Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Vektor gen kanggo perawatan fibrosis kistik paru kudu ditargetake menyang saluran napas konduktif, amarga transduksi paru-paru perifer ora duwe efek terapeutik.Efisiensi transduksi virus langsung ana hubungane karo wektu panggonan operator.Nanging, cairan pangiriman kayata pembawa gen kanthi alami nyebar menyang alveoli sajrone inhalasi, lan partikel terapeutik kanthi bentuk apa wae kanthi cepet dibusak kanthi transportasi mukosiliar.Ngluwihi wektu manggon operator gen ing saluran pernapasan penting nanging angel digayuh.Partikel magnetik konjugasi pembawa sing bisa diarahake menyang permukaan saluran pernapasan bisa ningkatake penargetan regional.Amarga masalah pencitraan in vivo, prilaku partikel magnetik cilik ing permukaan saluran napas nalika ana medan magnet sing ditrapake kurang dimangerteni.Tujuan saka panliten iki yaiku nggunakake pencitraan synchrotron kanggo nggambarake in vivo gerakan partikel magnetik ing trakea tikus sing dibius supaya bisa nyinaoni dinamika lan pola prilaku partikel tunggal lan akeh ing vivo.Kita banjur uga netepake manawa pangiriman partikel magnetik lentiviral ing ngarsane medan magnet bakal nambah efisiensi transduksi ing trakea tikus.Pencitraan sinar-X Synchrotron nuduhake prilaku partikel magnetik ing medan magnet stasioner lan obah in vitro lan in vivo.Partikel ora bisa gampang diseret ing lumahing saluran udara urip kanthi nggunakake magnet, nanging sajrone transportasi, celengan dikonsentrasi ing bidang pandang, ing ngendi medan magnet paling kuat.Efisiensi transduksi uga tambah kaping enem nalika partikel magnetik lentiviral dikirim ing ngarsane medan magnet.Digabungake, asil kasebut nuduhake manawa partikel magnetik lentiviral lan medan magnet bisa dadi pendekatan sing migunani kanggo nambah target vektor gen lan tingkat transduksi ing saluran napas konduktif ing vivo.
Fibrosis kistik (CF) disababaké déning variasi gen tunggal sing diarani CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Protein CFTR minangka saluran ion sing ana ing pirang-pirang sel epitelium ing awak, kalebu saluran napas, situs utama ing patogenesis fibrosis kistik.Cacat ing CFTR nyebabake transportasi banyu ora normal, dehidrasi permukaan saluran napas, lan ambane lapisan cairan permukaan saluran napas (ASL) mudhun.Uga ngrusak kemampuan sistem transportasi mucociliary (MCT) kanggo ngresiki saluran napas saka partikel lan patogen sing dihirup.Tujuane yaiku ngembangake terapi gen lentiviral (LV) kanggo ngirim salinan gen CFTR sing bener lan ningkatake kesehatan ASL, MCT, lan paru-paru, lan terus ngembangake teknologi anyar sing bisa ngukur parameter kasebut ing vivo1.
Vektor LV minangka salah sawijining calon utama terapi gen fibrosis kistik, utamane amarga bisa nggabungake gen terapeutik kanthi permanen menyang sel basal saluran napas (sel stem saluran napas).Iki penting amarga bisa mulihake hidrasi normal lan ngresiki mucus kanthi mbedakake menyang sel permukaan saluran napas sing dikoreksi gen fungsional sing ana hubungane karo fibrosis kistik, sing ngasilake keuntungan seumur hidup.Vektor LV kudu diarahake marang saluran napas konduktif, amarga ing kene keterlibatan paru-paru ing CF diwiwiti.Pangiriman vektor sing luwih jero menyang paru-paru bisa nyebabake transduksi alveolar, nanging iki ora duwe efek terapeutik ing fibrosis kistik.Nanging, cairan kayata operator gen kanthi alami migrasi menyang alveoli nalika dihirup sawise babaran3,4 lan partikel terapeutik kanthi cepet diusir menyang rongga lisan dening MCT.Efisiensi transduksi LV langsung ana hubungane karo suwene wektu vektor tetep cedhak karo sel target kanggo ngidini serapan seluler - "wektu panggonan" 5 sing gampang disingkat dening aliran udara regional sing khas uga penyerapan terkoordinasi saka lendir lan partikel MCT.Kanggo fibrosis kistik, kemampuan kanggo ndawakake wektu manggon LV ing saluran napas penting kanggo entuk tingkat transduksi sing dhuwur ing wilayah iki, nanging nganti saiki wis dadi tantangan.
Kanggo ngatasi alangan iki, kita ngusulake manawa partikel magnetik LV (MP) bisa mbantu kanthi rong cara pelengkap.Kaping pisanan, bisa dipandu dening magnet menyang permukaan saluran napas kanggo nambah penargetan lan mbantu partikel pembawa gen ana ing area saluran napas sing tepat;lan ASL) pindhah menyang lapisan sel. anane listrik statis.Medan Magnetik kanggo terapi kanker 7. Cara "hipertermik" liyane ditujokake kanggo mateni sel tumor kanthi memanasake MP nalika kena medan magnet sing oscillating.Prinsip transfeksi magnetik, ing ngendi medan magnet digunakake minangka agen transfeksi kanggo ningkatake transfer DNA menyang sel, umume digunakake ing vitro nggunakake sawetara vektor gen non-virus lan virus kanggo garis sel sing angel ditransduksi. ..Efisiensi magnetotransfeksi LV kanthi pangiriman LV MP in vitro menyang garis sel epitelium bronkial manungsa ing ngarsane medan magnet statis diadegake, nambah efisiensi transduksi kaping 186 dibandhingake karo vektor LV piyambak.LV MT uga wis diterapake ing model in vitro fibrosis kistik, ing ngendi transfeksi magnetik nambah transduksi LV ing kultur antarmuka udara-cair kanthi faktor 20 ing ngarsane sputum fibrosis kistik10.Nanging, ing vivo organ magnetotransfection wis ditampa relatif sethitik manungsa waé lan mung wis dievaluasi ing sawetara pasinaon kewan11,12,13,14,15, utamané ing lungs16,17.Nanging, kemungkinan transfeksi magnetik ing terapi paru-paru ing fibrosis kistik jelas.Tan et al.(2020) nyatakake yen "sinau validasi babagan pangiriman paru-paru sing efektif saka nanopartikel magnetik bakal mbukak dalan kanggo strategi inhalasi CFTR ing mangsa ngarep kanggo nambah asil klinis ing pasien kanthi fibrosis kistik"6.
Prilaku partikel magnetik cilik ing permukaan saluran pernapasan ing ngarsane medan magnet sing ditrapake angel digambarake lan ditliti, lan mulane ora dingerteni.Ing pasinaon liyane, kita wis ngembangake metode Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) kanggo pencitraan non-invasif lan kuantifikasi owah-owahan menit ing vivo ing kedalaman ASL18 lan prilaku MCT19,20 kanggo langsung ngukur hidrasi permukaan saluran gas. lan digunakake minangka indikator awal efektifitas perawatan.Kajaba iku, metode pemarkahan MCT kita nggunakake partikel diameter 10–35 µm sing kasusun saka alumina utawa kaca indeks bias dhuwur minangka tandha MCT sing katon nganggo PB-PCXI21.Kaloro cara kasebut cocog kanggo nggambar macem-macem jinis partikel, kalebu MP.
Amarga resolusi spasial lan temporal sing dhuwur, tes ASL lan MCT berbasis PB-PCXI kita cocog kanggo nyinaoni dinamika lan pola prilaku partikel tunggal lan akeh ing vivo kanggo mbantu kita ngerti lan ngoptimalake cara pangiriman gen MP.Pendekatan sing digunakake ing kene adhedhasar studi kita nggunakake beamline SPring-8 BL20B2, ing ngendi kita nggambarake gerakan cairan sawise pangiriman dosis vektor goblok menyang saluran napas irung lan paru-paru tikus kanggo mbantu nerangake pola ekspresi gen heterogen sing diamati. ing gen kita.pasinaon kewan kanthi dosis operator 3.4.
Tujuan saka panliten iki yaiku nggunakake synchrotron PB-PCXI kanggo nggambarake gerakan in vivo saka seri MP ing trakea tikus urip.Pasinaon pencitraan PB-PCXI iki dirancang kanggo nguji seri MP, kekuatan medan magnet, lan lokasi kanggo nemtokake efek ing gerakan MP.Kita nganggep manawa medan magnet eksternal bakal mbantu MF sing dikirim tetep utawa pindhah menyang wilayah target.Panaliten kasebut uga ngidini kita nemtokake konfigurasi magnet sing maksimalake jumlah partikel sing isih ana ing trakea sawise deposisi.Ing seri kapindho pasinaon, kita ngarahake nggunakake konfigurasi optimal iki kanggo nduduhake pola transduksi asil saka pangiriman in vivo LV-MPs menyang saluran udara tikus, kanthi asumsi yen pangiriman LV-MP ing konteks penargetan saluran napas bakal nyebabake. ing tambah efisiensi transduksi LV..
Kabeh pasinaon kewan ditindakake miturut protokol sing disetujoni dening Universitas Adelaide (M-2019-060 lan M-2020-022) lan Komite Etika Kewan Synchrotron SPring-8.Eksperimen kasebut ditindakake miturut rekomendasi ARRIVE.
Kabeh gambar x-ray dijupuk ing beamline BL20XU ing synchrotron SPring-8 ing Jepang nggunakake persiyapan padha sing diterangake sadurunge 21,22.Sedhela, kothak eksperimen dumunung 245 m saka dering panyimpenan sinkrotron.Jarak sampel-kanggo-detektor 0,6 m digunakake kanggo studi pencitraan partikel lan 0,3 m kanggo studi imaging in vivo kanggo nggawe efek kontras fase.Beam monokromatik kanthi energi 25 keV digunakake.Gambar kasebut dipikolehi nggunakake transduser sinar-X resolusi dhuwur (SPring-8 BM3) ditambah karo detektor sCMOS.Transduser ngowahi sinar-X dadi cahya katon nggunakake scintillator kandel 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), sing banjur diarahake menyang sensor sCMOS nggunakake obyek mikroskop × 10 (NA 0.3).Detektor sCMOS yaiku Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) kanthi ukuran array 2048 × 2048 piksel lan ukuran piksel mentah 6,5 × 6,5 µm.Setelan iki menehi ukuran piksel isotropik efektif 0,51 µm lan lapangan tampilan kira-kira 1,1 mm × 1,1 mm.Durasi cahya 100 ms dipilih kanggo nggedhekake rasio sinyal-kanggo-noise partikel magnetik ing njero lan njaba saluran napas nalika nyilikake artefak gerakan sing disebabake dening napas.Kanggo studi in vivo, rana sinar-X sing cepet diselehake ing jalur sinar-X kanggo mbatesi dosis radiasi kanthi ngalangi sinar-X ing antarane eksposur.
Media LV ora digunakake ing studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI amarga kamar pencitraan BL20XU ora disertifikasi Biosafety Level 2.Nanging, kita milih sawetara MPs uga-ditandai saka loro vendor komersial panutup sawetara ukuran, bahan, konsentrasi wesi, lan aplikasi , - pisanan supaya ngerti carane Magnetik kolom mengaruhi gerakan MP ing kapiler kaca, lan banjur ing saluran napas urip.lumahing.Ukuran MP beda-beda gumantung saka 0,25 nganti 18 µm lan digawe saka macem-macem bahan (pirsani Tabel 1), nanging komposisi saben sampel, kalebu ukuran partikel magnetik ing MP, ora dingerteni.Adhedhasar studi MCT ekstensif kita 19, 20, 21, 23, 24, kita ngarepake yen MP nganti 5 µm bisa dideleng ing permukaan saluran napas trakea, contone, kanthi nyuda pigura berturut-turut kanggo ndeleng visibilitas gerakan MP sing luwih apik.MP siji 0.25 µm luwih cilik tinimbang resolusi piranti imaging, nanging PB-PCXI samesthine bisa ndeteksi kontras volumetrik lan gerakan cairan permukaan sing disimpen sawise disimpen.
Sampel kanggo saben MP ing meja.1 disiapake ing kapiler kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) kanthi diameter internal 0,63 mm.Partikel korpuskular kasedhiya ing banyu, dene partikel CombiMag kasedhiya ing cairan proprietary pabrikan.Saben tabung diisi setengah cairan (kira-kira 11 µl) lan diselehake ing wadhah sampel (pirsani Gambar 1).Kapiler kaca diselehake sacara horisontal ing panggung ing kamar pencitraan, lan dipanggonke ing pinggir cairan.Magnetik cangkang nikel kanthi diameter 19 mm (dawa 28 mm) digawe saka tanah jarang, neodymium, wesi lan boron (NdFeB) (N35, cat. No. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) kanthi remanensi 1,17 T dipasang ing a meja transfer kapisah kanggo entuk Kadohan ngganti posisi sak Rendering.Pencitraan sinar-X diwiwiti nalika magnet dipanggonke kira-kira 30 mm ing ndhuwur sampel lan gambar dipikolehi ing 4 pigura per detik.Sajrone pencitraan, magnet digawa cedhak karo tabung kapiler kaca (kanthi jarak kira-kira 1 mm) banjur dipindhah ing sadawane tabung kanggo netepake efek kekuatan lan posisi lapangan.
Persiyapan imaging in vitro ngemot sampel MP ing kapiler kaca ing tataran terjemahan saka sampel xy.Jalur sinar X ditandhani karo garis abang titik.
Sawise visibilitas in vitro saka MP ditetepake, subset saka wong-wong mau dites in vivo ing tikus albino Wistar jinis liar (~ 12 minggu, ~ 200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Jepang), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepang) lan butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Tikus dibius nganggo campuran Pharma (Jepang) kanthi injeksi intraperitoneal.Sawise anestesi, dheweke disiapake kanggo pencitraan kanthi ngilangi wulu ing sakubenge trakea, nglebokake tabung endotrakeal (ET; 16 Ga intravena kanula, Terumo BCT), lan immobilisasi ing posisi supine ing piring pencitraan sing digawe khusus sing ngemot tas termal. kanggo njaga suhu awak.22. Plat imaging banjur ditempelake ing tataran sampel ing kothak imaging ing amba tipis kanggo kempal trakea horisontal ing gambar x-ray minangka ditampilake ing Figure 2a.
(a) Persiyapan pencitraan in vivo ing unit pencitraan SPring-8, jalur sinar X-ray sing ditandhani nganggo garis titik abang.(b, c) Lokalisasi magnet trakea ditindakake kanthi jarak adoh nggunakake rong kamera IP sing dipasang sacara ortogonal.Ing sisih kiwa gambar ing layar, sampeyan bisa ndeleng daur ulang kabel nyekeli sirah lan cannula pangiriman dipasang ing tabung ET.
Sistem pompa jarum suntik sing dikontrol jarak jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) nggunakake jarum suntik kaca 100 µl disambungake menyang pipa PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) nggunakake jarum 30 Ga.Tandhani tabung kanggo mesthekake yen tip ana ing posisi sing bener ing trakea nalika nglebokake tabung endotrakeal.Nggunakake micropump, plunger syringe dicopot lan ujung tabung dicelupake ing sampel MP sing bakal dikirim.Tabung pangiriman sing dimuat banjur dilebokake menyang tabung endotrakeal, nempatake ujung ing sisih paling kuat saka medan magnet sing ditrapake.Akuisisi gambar dikontrol nggunakake detektor napas sing disambungake menyang kothak wektu adhedhasar Arduino, lan kabeh sinyal (umpamane, suhu, respirasi, rana mbukak / nutup, lan akuisisi gambar) direkam nggunakake Powerlab lan LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Nalika Imaging Nalika omah ora kasedhiya, loro kamera IP (Panasonic BB-SC382) dipanggonke ing kira-kira 90 ° kanggo saben liyane lan digunakake kanggo ngontrol posisi magnet relatif kanggo trakea sak imaging (Figure 2b, c).Kanggo nyilikake artefak gerakan, siji gambar saben napas dipikolehi sajrone dataran tinggi aliran pernapasan terminal.
Magnetik ditempelake ing tahap kapindho, sing bisa uga ana ing njaba awak pencitraan.Macem-macem posisi lan konfigurasi magnet dites, kalebu: diselehake ing sudut kira-kira 30 ° ing ndhuwur trakea (konfigurasi ditampilake ing Gambar 2a lan 3a);siji magnet ing ndhuwur kewan lan liyane ing ngisor, karo cagak disetel kanggo atraksi (Figure 3b)., siji magnet ing ndhuwur kewan lan siji ing ngisor, kanthi kutub disetel kanggo tolak (Gambar 3c), lan siji magnet ing ndhuwur lan jejeg trakea (Gambar 3d).Sawise nyetel kewan lan magnet lan ngemot MP sing dites menyang pompa jarum suntik, kirimake dosis 50 µl kanthi kecepatan 4 µl / detik nalika njupuk gambar.Magnetik banjur dipindhah bolak-balik ing sadawane utawa ngliwati trakea nalika terus entuk gambar.
Konfigurasi magnet kanggo pencitraan in vivo (a) siji magnet ing ndhuwur trakea kanthi sudut kira-kira 30 °, (b) rong magnet sing dikonfigurasi kanggo narik kawigaten, (c) rong magnet sing dikonfigurasi kanggo tolak, (d) siji magnet ing ndhuwur lan jejeg menyang trakea.Pengamat nyawang mudhun saka tutuk menyang paru-paru liwat trakea lan sinar X-ray ngliwati sisih kiwa tikus lan metu saka sisih tengen.Magnetik kasebut dipindhah ing sadawane saluran napas utawa ngiwa lan nengen ing ndhuwur trakea menyang arah sinar X.
Kita uga ngupaya kanggo nemtokake visibilitas lan prilaku partikel ing saluran napas tanpa campuran ambegan lan denyut jantung.Mulane, ing pungkasan periode pencitraan, kewan-kewan dibunuh sacara manusiawi amarga overdosis pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip).Sawetara kewan ditinggalake ing platform pencitraan, lan sawise mandheg ambegan lan deg-degan, proses pencitraan diulang maneh, nambah dosis tambahan MP yen ora ana MP sing katon ing permukaan saluran napas.
Gambar sing diasilake didandani kanggo lapangan sing rata lan peteng banjur dirakit dadi film (20 frame per detik; 15-25 × kecepatan normal gumantung saka tingkat respirasi) nggunakake skrip khusus sing ditulis ing MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Kabeh studi babagan pangiriman vektor gen LV ditindakake ing Pusat Riset Kewan Laboratorium Universitas Adelaide lan ngarahake nggunakake asil eksperimen SPring-8 kanggo netepake manawa pangiriman LV-MP ing ngarsane medan magnet bisa ningkatake transfer gen ing vivo. .Kanggo ngevaluasi efek MF lan medan magnet, rong klompok kewan diobati: siji klompok disuntikake karo LV MF kanthi penempatan magnet, lan klompok liyane disuntikake karo klompok kontrol karo LV MF tanpa magnet.
Vektor gen LV wis digawe nggunakake cara sing diterangake sadurunge 25, 26.Vektor LacZ nuduhake gen beta-galactosidase lokal nuklir sing didorong dening promotor konstitutif MPSV (LV-LacZ), sing ngasilake produk reaksi biru ing sel transduksi, katon ing ngarep lan bagean jaringan paru-paru.Titrasi ditindakake ing kultur sel kanthi ngitung jumlah sel positif LacZ kanthi manual nggunakake hemocytometer kanggo ngetung titer ing TU / ml.Carriers cryopreserved ing -80 ° C, thawed sadurunge digunakake, lan bound kanggo CombiMag dening nyampur 1:1 lan inkubasi ing es kanggo paling 30 menit sadurunge pangiriman.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3/kelompok, ~2-3 ip dibius kanthi campuran 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) lan 60mg/kg ketamin (Ilium, Australia) ing umur 1 sasi) ip ) injeksi lan kanulasi lisan non-bedah kanthi kanula intravena 16 Ga.Kanggo mesthekake yen jaringan saluran napas trakea nampa transduksi LV, dikondisikake nggunakake protokol gangguan mekanik sing wis diterangake sadurunge ing permukaan saluran napas trakea digosok kanthi aksial nganggo kranjang kawat (N-Circle, ekstraktor watu nitinol tanpa tip NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 p28.Banjur, kira-kira 10 menit sawise gangguan ing kabinet biosafety, administrasi trakea LV-MP ditindakake.
Medan magnet sing digunakake ing eksperimen iki dikonfigurasi kanthi cara sing padha karo studi sinar x in vivo, kanthi magnet sing padha ditahan ing trakea kanthi clamp stent distilasi (Gambar 4).Volume 50 µl (2 x 25 µl aliquots) saka LV-MP dikirim menyang trakea (n = 3 kewan) nggunakake pipette gel-tipped minangka diterangake sadurunge.Klompok kontrol (n = 3 kéwan) nampa LV-MP padha tanpa nggunakake magnet.Sawise infus rampung, kanula dicopot saka tabung endotrakeal lan kewan kasebut diekstubasi.Magnet tetep ing panggonan kanggo 10 menit sadurunge dibusak.Tikus diwenehi dosis subkutan kanthi meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia) banjur dibuwang kanthi anestesi kanthi injeksi intraperitoneal 1 mg / kg atipamazole hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Australia).Tikus tetep anget lan diamati nganti pulih saka anestesi.
Piranti pangiriman LV-MP ing lemari safety biologis.Sampeyan bisa ndeleng manawa lengen klambi Luer-kunci abu-abu cahya saka tabung ET metu saka tutuk, lan tip pipette gel sing ditampilake ing gambar kasebut dilebokake liwat tabung ET menyang ambane sing dikarepake menyang trakea.
Seminggu sawise prosedur administrasi LV-MP, kewan dikorbanake kanthi manungsa kanthi inhalasi 100% CO2 lan ekspresi LacZ ditaksir nggunakake perawatan X-gal standar.Telung dering balung rawan paling caudal dibusak kanggo mesthekake yen karusakan mekanik utawa retensi cairan amarga penempatan tabung endotrakeal ora bakal kalebu ing analisis.Saben trakea dipotong kanthi dawa kanggo entuk rong bagian kanggo dianalisis lan diselehake ing cangkir sing ngemot karet silikon (Sylgard, Dow Inc) nggunakake jarum Minutien (Fine Science Tools) kanggo nggambarake permukaan luminal.Distribusi lan karakter sel transduksi dikonfirmasi dening fotografi frontal nggunakake mikroskop Nikon (SMZ1500) karo kamera DigiLite lan piranti lunak TCapture (Tucsen Photonics, China).Gambar dipikolehi kanthi perbesaran 20x (kalebu setelan maksimal kanggo jembaré trakea), kanthi dawa trakea ditampilake langkah demi langkah, nyedhiyakake tumpang tindih sing cukup ing antarane saben gambar supaya gambar bisa "dijahit".Gambar saka saben trakea banjur digabung dadi siji gambar komposit nggunakake Composite Image Editor versi 2.0.3 (Microsoft Research) nggunakake algoritma planar motion. Area ekspresi LacZ ing gambar komposit trakea saka saben kewan diukur nggunakake skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) kaya sing wis diterangake sadurunge28, nggunakake setelan 0.35 <Hue <0.58, Saturasi> 0.15, lan Nilai <0.7. Area ekspresi LacZ ing gambar komposit trakea saka saben kewan diukur nggunakake skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) kaya sing wis diterangake sadurunge28, nggunakake setelan 0.35 <Hue <0.58, Saturasi> 0.15, lan Nilai <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Area ekspresi LacZ ing gambar trakea komposit saka saben kewan diukur nganggo skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) kaya sing wis diterangake sadurunge28 nggunakake setelan 0.350.15 lan nilai <0.7.如 前所前所, 使用 自动 Matlab 脚本 (R2020A, Mathworks) 对 的 的 气管 图像 的 的气管 的 气管 的图像 的量化 的 的区域 的中 的表达 的中 的表达 的表达 的表达 的表达 的表达 的表达 的表达 的表达 的表达 的表达 的表达 区域表达 区域表达 区域表达 区域表达 区域表达 区域表达 区域表达 区域表达 区域 区域区域量化, 0 0.15 和值 <0.15 和值 <0,7 的如如 述, 自动 自动 matlab 脚本 ((R2020a, MathWorks) 来自 复合 只 的 的气管 图像 的 的 的 表达表达量化, 使用 的 使用 0.35,> 0.15 和值 <0.7 的 <0.7 的 <.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Wilayah ekspresi LacZ ing gambar gabungan saka trakea saben kewan diukur nggunakake skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) kaya sing wis diterangake sadurunge nggunakake setelan 0,35 < hue <0,58, jenuh> 0,15 lan nilai <0,7.Kanthi nelusuri kontur jaringan ing GIMP v2.10.24, topeng digawe kanthi manual kanggo saben gambar gabungan kanggo ngenali area jaringan lan nyegah deteksi palsu ing njaba jaringan trakea.Wilayah sing diwarnai saka kabeh gambar komposit saka saben kewan dijumlahake kanggo menehi total area sing diwarnai kanggo kewan kasebut.Wilayah sing dicet banjur dibagi karo total area topeng kanggo entuk area sing normal.
Saben trakea dilebokake ing parafin lan dipotong kanthi ketebalan 5 µm.Bagean padha counterstained karo netral cepet abang kanggo 5 menit lan gambar dijupuk nggunakake mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 lan piranti lunak jupuk unsur NIS (versi 5.20.00).
Kabeh analisis statistik ditindakake ing GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Signifikansi statistik disetel ing p ≤ 0,05.Normalitas dites nggunakake tes Shapiro-Wilk lan beda ing pewarnaan LacZ ditaksir nggunakake t-test sing ora berpasangan.
Enem MP sing diterangake ing Tabel 1 diteliti dening PCXI, lan visibilitas diterangake ing Tabel 2. Rong MP1 polystyrene (MP1 lan MP2; 18 µm lan 0.25 µm, masing-masing) ora katon dening PCXI, nanging sampel sing isih bisa diidentifikasi. (conto ditampilake ing Figure 5).MP3 lan MP4 katon banget (10-15% Fe3O4; 0,25 µm lan 0,9 µm, mungguh).Sanajan MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) ngemot sawetara partikel paling cilik sing diuji, nanging sing paling jelas.Produk CombiMag MP6 angel dibedakake.Ing kabeh kasus, kemampuan kita kanggo ndeteksi MF wis apik banget dening obah magnet bali lan kasebut podo karo kapiler.Minangka wesi sembrani dipindhah adoh saka kapiler, partikel padha ditarik metu ing rentengan dawa, nanging minangka wesi sembrani nyedhaki lan kekuatan Magnetik kolom mundhak, rentengan partikel shortened minangka partikel migrasi menyang lumahing ndhuwur kapiler (pirsani Video Tambahan S1). : MP4), nambah Kapadhetan partikel ing lumahing.Kosok baline, nalika sembrani dibusak saka kapiler, kekuatan lapangan sudo lan MPs ngatur maneh menyang rentengan dawa ndawakake saka lumahing ndhuwur kapiler (ndeleng Video Tambahan S2: MP4).Sawise magnet mandheg obah, partikel terus obah sawetara wektu sawise tekan posisi keseimbangan.Nalika MP pindhah menyang lan adoh saka permukaan ndhuwur kapiler, partikel magnetik cenderung narik lebu liwat cairan kasebut.
Visibilitas MP ing PCXI beda-beda ing antarane sampel.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 lan (d) MP6.Kabeh gambar sing ditampilake ing kene dijupuk nganggo magnet sing dipasang kira-kira 10 mm langsung ing ndhuwur kapiler.Bunder gedhe sing katon yaiku gelembung udara sing kepepet ing kapiler, kanthi jelas nuduhake fitur pinggiran ireng lan putih saka gambar kontras fase.Kothak abang nuduhake perbesaran sing nambah kontras.Elinga yen dhiameter sirkuit magnet ing kabeh gambar ora ukurane lan kira-kira 100 kaping luwih gedhe tinimbang sing ditampilake.
Nalika sembrani gerakane ngiwa lan nengen ing ndhuwur kapiler, amba saka senar MP ngganti kanggo selaras karo magnet (ndeleng Figure 6), mangkono delineating garis Magnetik kolom.Kanggo MP3-5, sawise kord tekan sudut ambang, partikel kasebut nyeret ing permukaan ndhuwur kapiler.Iki asring nyebabake anggota parlemen dadi klompok sing luwih gedhe ing endi medan magnet paling kuat (pirsani Video Tambahan S3: MP5).Iki uga utamané bukti nalika imaging cedhak mburi kapiler, kang nimbulaké MP kanggo aggregate lan musataken ing antarmuka Cairan-udhara.Partikel ing MP6, sing luwih angel dibedakake tinimbang sing ana ing MP3-5, ora nyeret nalika magnet dipindhah ing kapiler, nanging senar MP dissociated, ninggalake partikel katon (pirsani Video Tambahan S4: MP6).Ing sawetara kasus, nalika medan magnet sing ditrapake dikurangi kanthi ngobahake magnet kanthi jarak sing adoh saka situs pencitraan, MP sing isih ana alon-alon mudhun menyang permukaan ngisor tabung kanthi gravitasi, tetep ana ing senar (pirsani Video Tambahan S5: MP3). .
Sudut senar MP owah-owahan nalika magnet pindhah menyang sisih tengen ndhuwur kapiler.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 lan (d) MP6.Kothak abang nuduhake perbesaran sing nambah kontras.Wigati dimangerteni manawa video tambahan kasebut kanggo tujuan informasi amarga nuduhake struktur partikel penting lan informasi dinamis sing ora bisa dideleng ing gambar statis kasebut.
Tes kita nuduhake manawa ngobahake magnet kanthi alon-alon ing trakea nggampangake visualisasi MF ing konteks gerakan kompleks ing vivo.Ora ana tes in vivo sing ditindakake amarga manik polystyrene (MP1 lan MP2) ora katon ing kapiler.Saben patang MF sing isih ana dites in vivo kanthi sumbu dawa magnet sing dipanggonke ing trakea kanthi sudut kira-kira 30 ° menyang vertikal (pirsani Gambar 2b lan 3a), amarga iki nyebabake rantai MF luwih dawa lan luwih efektif. tinimbang magnet..konfigurasi mungkasi.MP3, MP4 lan MP6 durung ditemokake ing trakea kewan urip.Nalika nggambarake saluran pernapasan tikus sawise mateni kewan kanthi manungsa, partikel kasebut tetep ora katon sanajan volume tambahan ditambahake nggunakake pompa syringe.MP5 nduweni kandungan oksida wesi paling dhuwur lan mung partikel sing katon, mula digunakake kanggo ngevaluasi lan menehi ciri prilaku MP ing vivo.
Penempatan magnet ing trakea sajrone nglebokake MF nyebabake akeh, nanging ora kabeh, MF konsentrasi ing bidang pandang.Entri partikel ing trakea paling apik diamati ing kewan sing ditindhes manungsa.Gambar 7 lan Video Tambahan S6: MP5 nuduhake panangkepan magnetik kanthi cepet lan alignment partikel ing lumahing trakea ventral, nuduhake yen MP bisa diangkah menyang wilayah sing dikarepake ing trakea.Nalika nggoleki luwih adoh ing sadawane trakea sawise pangiriman MF, sawetara MF ditemokake luwih cedhak karo carina, sing nuduhake kekuatan medan magnet sing ora cukup kanggo ngumpulake lan nahan kabeh MF, amarga dikirim liwat wilayah kekuatan medan magnet maksimum sajrone administrasi cairan.proses.Nanging, konsentrasi MP postnatal luwih dhuwur ing sekitar area gambar, nuduhake yen akeh MP tetep ana ing wilayah saluran napas ing ngendi kekuatan medan magnet sing ditrapake paling dhuwur.
Gambar (a) sadurunge lan (b) sawise ngirim MP5 menyang trakea tikus sing mentas euthanized kanthi magnet diselehake ing ndhuwur area pencitraan.Wilayah sing digambarake dumunung ing antarane rong cincin cartilaginous.Ana sawetara cairan ing saluran napas sadurunge MP dikirim.Kothak abang nuduhake perbesaran sing nambah kontras.Gambar kasebut dijupuk saka video sing ditampilake ing S6: Video Tambahan MP5.
Ngalihake magnet ing sadawane trakea ing vivo nyebabake owah-owahan ing sudut rantai MP ing permukaan saluran napas, padha karo sing diamati ing kapiler (pirsani Gambar 8 lan Video Tambahan S7: MP5).Nanging, ing panliten kita, anggota parlemen ora bisa diseret ing permukaan saluran pernapasan sing urip, kaya sing bisa ditindakake kapiler.Ing sawetara kasus, chain MP lengthens minangka sembrani gerakane ngiwa lan nengen.Apike, kita uga nemokake yen rantai partikel ngganti ambane lapisan permukaan cairan nalika magnet dipindhah longitudinally ing trakea, lan ngembangake nalika magnet dipindhah langsung ing ndhuwur lan rantai partikel diputar menyang posisi vertikal (ndeleng). Video Tambahan S7).: MP5 ing 0:09, tengen ngisor).Pola gerakan karakteristik diganti nalika magnet dipindhah ing sisih ndhuwur trakea (yaiku, ing kiwa utawa tengen kewan, tinimbang ing dawa trakea).Partikel-partikel kasebut isih katon kanthi jelas sajrone gerakane, nanging nalika magnet dicopot saka trakea, ujung-ujung senar partikel katon (pirsani Video Tambahan S8: MP5, wiwit jam 0:08).Iki sarujuk karo prilaku diamati saka Magnetik kolom ing tumindak saka Magnetik Magnetik Applied ing kaca kapiler.
Gambar conto sing nuduhake MP5 ing trakea tikus sing dibius urip.(a) Magnetik digunakake kanggo njupuk gambar ing ndhuwur lan ing sisih kiwa trakea, banjur (b) sawise ngobahake magnet ing sisih tengen.Kothak abang nuduhake perbesaran sing nambah kontras.Gambar kasebut saka video sing ditampilake ing Video Tambahan S7: MP5.
Nalika loro kutub kasebut disetel ing orientasi lor-kidul ing ndhuwur lan ngisor trakea (yaiku, narik; Gambar 3b), kord MP katon luwih dawa lan dumunung ing tembok lateral trakea tinimbang ing permukaan dorsal saka trakea. trakea (pirsani Lampiran).Video S9:MP5).Nanging, konsentrasi partikel sing dhuwur ing siji situs (yaiku, permukaan dorsal trakea) ora dideteksi sawise administrasi cairan nggunakake piranti magnet ganda, sing biasane ana karo piranti magnet tunggal.Banjur, nalika siji magnet dikonfigurasi kanggo ngusir kutub ngelawan (Gambar 3c), jumlah partikel sing katon ing bidang tampilan ora mundhak sawise pangiriman.Nyetel loro konfigurasi magnet kasebut angel amarga kekuwatan medan magnet sing dhuwur sing narik utawa nyurung magnet kasebut.Persiyapan kasebut banjur diganti dadi magnet siji sing sejajar karo saluran napas nanging ngliwati saluran napas kanthi sudut 90 derajat supaya garis gaya nyabrang tembok trakea kanthi ortogonal (Gambar 3d), orientasi sing dimaksudake kanggo nemtokake kemungkinan agregasi partikel ing tembok lateral.diamati.Nanging, ing konfigurasi iki, ora ana gerakan akumulasi MF utawa gerakan magnet sing bisa dingerteni.Adhedhasar kabeh asil kasebut, konfigurasi kanthi magnet siji lan orientasi 30 derajat dipilih kanggo studi in vivo operator gen (Fig. 3a).
Nalika kewan kasebut dicithak kaping pirang-pirang sanalika sawise dikorbanake kanthi manungsa, ora ana gerakan jaringan sing ngganggu tegese garis partikel sing luwih apik lan luwih cendhek bisa ditemokake ing lapangan intercartilaginous sing cetha, 'swaying' sesuai karo gerakan translasi magnet.cetha ndeleng ngarsane lan gerakan saka MP6 partikel.
Titer LV-LacZ yaiku 1,8 x 108 IU/mL, lan sawise nyampur 1:1 karo CombiMag MP (MP6), kewan disuntikake 50 µl dosis trakea 9 x 107 IU/ml kendaraan LV (yaiku 4,5). x 106 TU/tikus).)).Ing panliten kasebut, tinimbang ngobahake magnet sajrone tenaga kerja, kita ndandani magnet ing siji posisi kanggo nemtokake manawa transduksi LV bisa (a) luwih apik dibandhingake karo pangiriman vektor tanpa ana medan magnet, lan (b) yen saluran napas bisa. dadi fokus.Sèl-sèl sing ditransduksi ing area target magnetik ing saluran pernapasan ndhuwur.
Ing ngarsane magnet lan nggunakake CombiMag ing kombinasi karo LV vektor ora katon ngrugekake kanggo kesehatan kewan, kaya protokol pangiriman vektor LV standar kita.Gambar frontal saka wilayah trakea ngalami gangguan mekanik (Gambar Tambahan 1) nuduhake yen klompok sing diobati LV-MP nduweni tingkat transduksi sing luwih dhuwur ing ngarsane magnet (Gambar 9a).Mung sawetara pewarnaan LacZ biru sing ana ing klompok kontrol (Gambar 9b).Kuantifikasi wilayah normalisasi sing diwarnai X-Gal nuduhake yen administrasi LV-MP ing ngarsane medan magnet nyebabake paningkatan kira-kira 6 kali (Fig. 9c).
Conto gambar komposit sing nuduhake transduksi trakea kanthi LV-MP (a) ing ngarsane medan magnet lan (b) tanpa magnet.(c) Peningkatan sing signifikan sacara statistik ing area normalisasi transduksi LacZ ing trakea kanthi nggunakake magnet (*p = 0.029, t-test, n = 3 saben klompok, rata-rata ± kesalahan standar rata-rata).
Bagean sing diwarnai abang kanthi cepet Neutral (conto ditampilake ing Gambar Tambahan 2) nuduhake yen sel sing diwarnai LacZ ana ing sampel sing padha lan ing lokasi sing padha kaya sing dilaporake sadurunge.
Tantangan utama ing terapi gen saluran napas tetep lokalisasi partikel pembawa sing tepat ing wilayah sing dikarepake lan entuk efisiensi transduksi tingkat dhuwur ing paru-paru seluler ing ngarsane aliran udara lan reresik mucus aktif.Kanggo operator LV sing dimaksudake kanggo perawatan penyakit pernapasan ing fibrosis kistik, nambah wektu panggonan partikel operator ing saluran udara konduktif nganti saiki dadi tujuan sing ora bisa ditindakake.Minangka dituduhake dening Castellani et al., panggunaan medan magnet kanggo ningkatake transduksi nduweni kaluwihan tinimbang cara pangiriman gen liyane kayata elektroporasi amarga bisa nggabungake kesederhanaan, ekonomi, pangiriman lokal, efisiensi tambah, lan wektu inkubasi sing luwih cendhek.lan bisa uga dosis kendaraan sing luwih murah10.Nanging, deposisi in vivo lan prilaku partikel magnetik ing saluran napas ing pengaruh gaya magnet eksternal durung nate diterangake, lan nyatane kemampuan metode iki kanggo nambah tingkat ekspresi gen ing saluran napas urip sing utuh durung ditampilake ing vivo.
Eksperimen in vitro ing synchrotron PCXI nuduhake yen kabeh partikel sing dites, kajaba polystyrene MP, katon ing persiyapan pencitraan sing digunakake.Ing ngarsane medan magnet, medan magnet mbentuk senar, dawane ana hubungane karo jinis partikel lan kekuwatan medan magnet (yaiku, jarak lan gerakan magnet).Minangka ditampilake ing Figure 10, strings kita mirsani kawangun minangka saben partikel individu dadi magnetized lan ngindhuksi medan magnet lokal dhewe.Bidang sing kapisah iki nyebabake partikel liyane sing padha kanggo ngumpulake lan nyambungake karo gerakan string grup amarga pasukan lokal saka gaya tarik lokal lan tolak partikel liyane.
Diagram sing nuduhake (a, b) rantai partikel sing ana ing njero kapiler sing diisi cairan lan (c, d) trakea sing diisi udara.Elinga yen kapiler lan trakea ora digambar kanthi skala.Panel (a) uga ngemot katrangan babagan MF sing ngemot partikel Fe3O4 sing disusun ing ranté.
Nalika sembrani dipindhah liwat kapiler, amba saka senar partikel tekan ambang kritis kanggo MP3-5 ngemot Fe3O4, sawise senar partikel ora maneh tetep ing posisi asli, nanging dipindhah bebarengan lumahing kanggo posisi anyar.magnet.Efek iki bisa kedadeyan amarga permukaan kapiler kaca cukup lancar kanggo ngidini gerakan iki kedadeyan.Sing nggumunake, MP6 (CombiMag) ora tumindak kaya ngono, bisa uga amarga partikel kasebut luwih cilik, duwe lapisan lapisan utawa permukaan sing beda, utawa cairan pembawa kepemilikan mengaruhi kemampuane kanggo mindhah.Kontras ing gambar partikel CombiMag uga ora pati roso, nuduhake yen cairan lan partikel bisa duwe Kapadhetan padha lan mulane ora bisa gampang pindhah menyang siji liyane.Partikel uga bisa macet yen sembrani obahe cepet banget, nuduhake yen kekuatan medan Magnetik ora tansah bisa ngatasi gesekan antarane partikel ing adi, suggesting sing kekuatan Magnetik kolom lan jarak antarane magnet lan area target ngirim ora teka minangka a kaget.penting.Asil iki uga nuduhake yen sembrani bisa nangkep akeh microparticles mili liwat wilayah target, iku dipercaya sing wesi sembrani bisa dipercaya kanggo mindhah partikel CombiMag ing lumahing trakea.Mangkono, kita nyimpulake yen studi vivo LV MF kudu nggunakake medan magnet statis kanggo target fisik area tartamtu saka wit saluran napas.
Sawise partikel dikirim menyang awak, angel diidentifikasi ing konteks jaringan obah kompleks awak, nanging kemampuan deteksi wis ditingkatake kanthi ngobahake magnet kanthi horisontal liwat trakea kanggo "goyang" senar MP.Nalika pencitraan wektu nyata bisa ditindakake, luwih gampang kanggo mbedakake gerakan partikel sawise kewan kasebut dipateni kanthi manungsa.Konsentrasi MP biasane paling dhuwur ing lokasi iki nalika magnet dipanggonke ing area pencitraan, sanajan sawetara partikel biasane ditemokake ing ngisor trakea.Ora kaya studi in vitro, partikel ora bisa diseret mudhun ing trakea kanthi gerakan magnet.Temuan iki konsisten karo carane lendhut sing nutupi permukaan trakea biasane ngolah partikel sing dihirup, nangkep ing lendhut lan banjur ngresiki liwat mekanisme reresik muco-ciliary.
We hypothesized sing nggunakake wesi sembrani ndhuwur lan ngisor trakea kanggo atraksi (Fig. 3b) bisa kasil Magnetik kolom liyane seragam, tinimbang Magnetik kolom sing Highly klempakan ing siji titik, duweni potensi asil ing distribusi liyane seragam saka partikel..Nanging, studi pendahuluan kita ora nemokake bukti sing jelas kanggo ndhukung hipotesis iki.Kajaba iku, nyetel sepasang magnet kanggo repulse (Fig. 3c) ora nyebabake partikel luwih akeh ing area gambar.Iki loro temonan nduduhake yen persiyapan dual-magnet ora Ngartekno nambah kontrol lokal MP pointing, lan sing asil pasukan Magnetik kuwat angel kanggo nyetel, nggawe pendekatan iki kurang praktis.Kajaba iku, orientasi magnet ing ndhuwur lan ngliwati trakea (Gambar 3d) uga ora nambah jumlah partikel sing isih ana ing area sing digambar.Sawetara konfigurasi alternatif iki bisa uga ora sukses amarga bisa nyuda kekuwatan medan magnet ing zona deposisi.Mangkono, konfigurasi magnet tunggal ing 30 derajat (Fig. 3a) dianggep paling gampang lan paling efisien ing cara testing vivo.
Panliten LV-MP nuduhake yen nalika vektor LV digabungake karo CombiMag lan dikirim sawise diganggu sacara fisik ing ngarsane medan magnet, tingkat transduksi tambah akeh ing trakea dibandhingake karo kontrol.Adhedhasar studi pencitraan synchrotron lan asil LacZ, medan magnet katon bisa njaga LV ing trakea lan ngurangi jumlah partikel vektor sing langsung nembus menyang paru-paru.Peningkatan penargetan kasebut bisa nyebabake efisiensi sing luwih dhuwur nalika nyuda titer sing dikirim, transduksi non-target, efek samping inflamasi lan kekebalan, lan biaya transfer gen.Sing penting, miturut pabrikan, CombiMag bisa digunakake kanthi kombinasi cara transfer gen liyane, kalebu vektor virus liyane (kayata AAV) lan asam nukleat.