Giardia duodenum minangka organisme parasit sing nyebabake giardiasis, infèksi usus utamané umum ing bocah cilik kanthi gejala klinis diare.Kita sadurunge wis nglapurake yen ekstraselular G. duodenalis micu aktivasi intraselular oligomerization-like receptor 3 (NLRP3) ngiket nukleotida lan ngatur respon inflamasi host liwat sekresi vesikel ekstraselular (EV).Nanging, pola molekul sing tepat saka EV duodenokokus sing gegandhengan karo patogen (GEV) sing ana ing proses iki lan peran inflammasom NLRP3 ing giardiasis tetep dijlentrehake.
Plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1 (+) -alpha-2 lan alpha-7.3 giardins ing GEV dibangun, ditransfeksi menyang makrofag peritoneal utama tikus, lan dideteksi kanthi ngukur molekul target inflamasi caspase-1.Tingkat ekspresi p20 disaring..G. duodenalis alpha-2 lan alpha-7.3 giardines wiwitane diidentifikasi kanthi ngukur inflammasome NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 lan caspase-1 p20), sekresi IL.1β, tingkat oligomerisasi protein apoptosis (ASC), lan lokalisasi imunofluoresen NLRP3 lan ASC.Peranan inflammasome NLRP3 ing patogenisitas G. duodenalis banjur ditaksir nggunakake tikus ing ngendi aktivasi NLRP3 diblokir (tikus sing diblokir NLRP3) lan owah-owahan patologis ing bobot awak, beban parasit duodenal, lan jaringan duodenum dipantau.Kajaba iku, kita nyelidiki manawa hiardin alpha-2 lan alpha-7.3 ngindhuksi sekresi IL-1β ing vivo liwat inflammasome NLRP3 lan nemtokake peran molekul kasebut ing patogenisitas G. duodenalis ing tikus.
Alpha-2 lan alpha-7.3 giardines ngindhuksi aktivasi inflammasome NLRP3 in vitro.Iki nyebabake aktivasi p20 caspase-1, paningkatan tingkat ekspresi NLRP3, pro-IL-1β, lan pro-caspase-1 protein, paningkatan sing signifikan ing sekresi IL-1β, pembentukan bintik ASA ing sitoplasma, lan induksi oligomerisasi ASA.NLRP3 inflammation Penile mundhut exacerbates pathogenicity saka G. duodenalis ing clurut.Tikus sing diobati kista kanthi gavage saka tikus sing diblokir NLRP3 nuduhake jumlah trofozoit sing tambah akeh lan karusakan abot ing villi duodenal, sing ditondoi dening crypts necrotic kanthi nyusut lan ngepang.Eksperimen ing vivo nuduhake yen giardine alpha-2 lan alpha-7.3 bisa nyebabake sekresi IL-1β liwat inflammasome NLRP3, lan imunisasi karo giardine alpha-2 lan alpha-7.3 nyuda patogenisitas G. duodenalis ing tikus.
Digabungake, asil panaliten iki nuduhake yen giardia alpha-2 lan alpha-7.3 nyebabake upregulation saka inflamasi NLRP3 host lan nyuda infektivitas G. duodenalis ing tikus, sing dadi target sing njanjeni kanggo nyegah giardiasis.
Giardia duodenum minangka parasit protozoa ekstrasel sing urip ing usus cilik lan nyebabake 280 yuta kasus giardiasis kanthi diare saben taun, utamane ing bocah cilik ing negara berkembang [1].Wong dadi infèksi kanthi ngombe banyu utawa panganan sing kena kontaminasi kista M. duodenum, sing banjur mlebu ing weteng lan diekskresi ing jus lambung.Giardia duodenum trophozoites nempel ing epitelium duodenum, nyebabake mual, muntah, diare, nyeri abdomen, lan bobot awak.Wong sing duwe immunodeficiency lan cystic fibrosis rentan kanggo infèksi.Infeksi uga bisa kedadeyan liwat oral lan anal sex [2].Obat-obatan kayata metronidazole, tinidazole, lan nitazoxanide minangka pilihan perawatan sing disenengi kanggo infeksi duodenum [3].Nanging, obat kemoterapi iki nyebabake efek samping kayata mual, karsinogenesis, lan genotoksisitas [4].Mulane, strategi sing luwih efektif kudu dikembangake kanggo nyegah infeksi G. duodenalis.
Inflammasom minangka kelas kompleks protein sitosolik sing minangka bagéan saka respon imun bawaan, mbantu nglawan invasi patogen lan mediasi respon inflamasi [5].Antarane inflammasom iki, nucleotide-binding oligomerization (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasome wis ditliti kanthi ekstensif amarga bisa dideteksi dening macem-macem pola molekuler patogen / karusakan (PAMP). DAMP), ngenali, ngaktifake sistem kekebalan bawaan.lan ngatur homeostasis usus ing akeh penyakit inflamasi [6,7,8].Iku kasusun saka reseptor pangenalan pola (PRR) NLRP3, adaptor apoptosis spotted protein (ASC), lan efektor procaspase-1 utawa procaspase-11.Inflammasome NLRP3 tumindak minangka inang marang invasi patogen, kaya sing diamati ing Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], lan studi Leishmania.[11], nanging uga wis dilapurake yen aktivasi inflammasome NLRP3 mbatesi respon imun protèktif lan exacerbates perkembangan penyakit, contone, ing cacing [12].Adhedhasar temuan sadurunge, kita nglapurake yen ekstraselular G. duodenalis micu aktivasi intraselular saka inflamasi NLRP3 lan modulates respon inflamasi host kanthi ngetokake vesikel ekstraselular (EVs) [13].Nanging, peran inflammasome NLRP3 ing infèksi G. duodenalis ing vivo tetep ditemtokake.
Giardins wiwitane diterangake minangka komponen struktural sitoskeleton G. duodenalis lan nduweni peran penting ing motilitas trophozoit lan lampiran sel epitelium ing usus cilik.Kanggo luwih adaptasi karo lingkungan lan nambah patogenisitas, G. duodenalis trophozoites ngembangake struktur sitoskeletal unik sing dumadi saka 8 flagella, 1 awak tengah, lan 1 cakram ventral [14].Trofozoit Giardia duodenum nggunakake sitoskeleton kanggo nembus usus cilik ndhuwur, utamane duodenum, lan nempel ing enterosit.Dheweke terus-terusan migrasi lan nempel ing sel epitelium nggunakake metabolisme sel.Mulane, ana hubungan sing cedhak antarane sitoskeleton lan virulensi.Giardine khusus kanggo Giardia duodenum minangka komponen struktur sitoskeleton [15] lan dipérang dadi papat kelas: α-, β-, γ-, lan δ-giardines.Ana 21 anggota saka kulawarga α-giardin, kabeh nduweni kemampuan gumantung kalsium kanggo ngiket fosfolipid [16].Dheweke uga nyambungake sitoskeleton menyang membran sel.Ing individu sing diare sing disebabake dening G. duodenalis, α-giardins banget diekspresiake lan immunoreaktif sajrone infeksi [17].Vaksin heterolog adhedhasar Giardia alfa-1 dilindhungi saka giardiasis ing tikus lan minangka calon antigen potensial kanggo pangembangan vaksin [18].Alpha-8 giardin, dilokalisasi ing membran plasma lan flagella, nanging ora ana ing disk ventral, ningkatake motilitas lan tingkat pertumbuhan trophozoites ing G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin nempel ing struktur microtubule ing flagella lan mengaruhi kelangsungan hidup G. duodenalis [20].Alpha-11 giardine ana akeh banget ing saindhenging siklus urip, lan overexpression alpha-11 giardine ngrusak G. duodenalis dhewe [21].Nanging, ora jelas apa alpha-2 giardine lan alpha-7.3 giardine minangka protèktif marang infeksi G. duodenalis lan mekanisme sing ndasari.
Ing panliten iki, plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine lan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ditransfeksi menyang makrofag peritoneal primer tikus kanggo ngaktifake host NLRP3.Target inflammasome banjur disaring.Kita uga ngevaluasi peran inflammasome NLRP3 ing patogenisitas G. duodenalis, nyelidiki apa alpha-2 lan alpha-7,3 giardines ngindhuksi aktivasi inflammasome NLRP3 ing vivo, lan nemtokake yen loro peran giardines ing patogenisitas saka G. duodenalis.Tujuan umum kita yaiku ngembangake target sing janjeni kanggo nyegah infeksi G. duodenalis.
Tikus betina jinis liar (WT) C57BL/6 umur 5-8 minggu dituku saka Pusat Kewan Eksperimen Liaoning Changsheng (Liaoning, China).Tikus duwe akses gratis menyang banyu, nampa panganan sing disterilisasi lan disimpen ing siklus cahya / peteng 12/12 jam.Sadurunge infeksi, tikus nampa antibiotik ad libitum ing banyu ngombe sing ditambah karo ampicillin (1 mg / mL), vankomisin (1 mg / mL), lan neomycin (1.4 mg / mL) (kabeh dituku saka Shanghai, China, organisme buatan) [22]. ].].Tikus sing ilang kemampuan kanggo mangan lan ngombe nganti> 24 jam lan ilang bobot awak ≥ 20% disingkirake kanthi manungsa kanthi dislokasi serviks.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) ditambah karo 12,5% ​​serum bovine fetal (FBS; Every Green, Zhejiang, China) lan 0,1% empedu sapi (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).USA) ing kahanan mikroaerobik.Trofozoit konfluen diklumpukake ing es lan dilewati kanthi rasio 1: 4 kanggo reproduksi luwih lanjut.
Kista Giardia duodenum diinduksi kaya sing diterangake sadurunge [23], trofozoit dipanen ing fase logaritmik lan banjur diencerke karo medium enkapsulasi inducing, pH 7.1 (TYI-S-33 sing diowahi) nganti konsentrasi pungkasan 1 × 106 trofozoit / mL.konsentrasi empedu 0,05% medium).Trophozoit dibudidaya ing kahanan anaerob ing suhu 37 ° C nganti fase pertumbuhan logaritmik.Ngganti medium kanggo medium inducing kista (pH 7.8; medium TYI-S-33 sing diowahi kanthi konsentrasi empedu 1%) lan kultur G. duodenalis ing 37 ° C kanggo 48-96 jam, sajrone kista pembentukan diamati ing mikroskop.Sawise sebagian besar trophozoit wis diinduksi kanggo mbentuk kista, campuran kultur dipanen lan disuspensi maneh ing banyu deionisasi steril kanggo lyse trofozoit sing isih ana.Kista diitung lan disimpen ing suhu 4 ° C kanggo analisis sabanjure liwat tabung lambung ing tikus.
Giardia ekstraselular vesikel (GEVs) diperkaya kaya sing diterangake sadurunge [13].Trophozoit ing fase pertumbuhan logaritmik digantung maneh ing medium TYI-S-33 sing dimodifikasi sing disiapake kanthi FBS exosome-depleted (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) nganti konsentrasi pungkasan 1 × 106 parasit / mL lan diinkubasi sajrone 12 jam.diisolasi saka supernatan kultur kanthi sentrifugasi ing 2000 g suwene 10 menit, 10.000 g suwene 45 menit, lan 100.000 g suwene 60 menit.Precipitates dibubarake ing saline buffered fosfat (PBS), diukur nggunakake kit assay protein BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) lan disimpen ing -80 ° C. utawa digunakake langsung kanggo analisis luwih lanjut.
Makrofag peritoneal mouse utama disiapake kaya sing diterangake sadurunge [24].Sedhela, tikus (umur 6-8 minggu) disuntikake (intraperitoneally [ip]) kanthi 2,5 ml medium thioglycol cair 2,98% Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) lan dipangan 3-4 palates.Suspensi makrofag diklumpukake saka rongga weteng tikus sawise euthanasia lan disentrifugasi kaping 3 ing 1000 g suwene 10 menit.Sel sing dipanen dideteksi kanthi flow cytometry nggunakake marker CD11b nganti kemurnian sel > 98%, banjur ditambahake ing piring kultur sel 6 sumur (4,5 x 106 sel / sumur) lan diinkubasi nganggo 10% FBS (Bioindustri) ing suhu 37 ° C.lan 5% CO2.
RNA diekstraksi saka 1 × 107 trofozoit ing 1 ml reagen TRIzol (Vazyme, Nanjing, China), DNA genom diekstraksi saka total G. duodenalis RNA nggunakake MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) lan DNA komplementer (cDNA) disintesis. nggunakake MonScript RTIIII Super Mix (Monad) miturut instruksi pabrik.
Informasi urutan CDS kanggo target G. duodenalis gen dijupuk saka NCBI GenBank.Gunakake Primer 5.0 kanggo ngrancang primer kloning mulus khusus kanggo saben gen target.Primer maju (5′-3′) kasusun saka telung bagean: urutan tumpang tindih karo vektor linearized pcDNA3.1 (+) EcoRV (TGGTGGAATTTCTGCAGAT) lan miwiti kodon ATG lan GNN (yen basa pisanan ora G).Iki ditindakake kanggo nambah efisiensi ekspresi.Kajaba iku, paling sethithik 16 bp basa gabungan (konten GC 40–60%/Tm kira-kira 55 °C).Primer mbalikke (5′-3′) kasusun saka rong bagéan, urutan tumpang tindih karo EcoRV-linearized vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) lan basis gabungan saka paling 16 bp.(ora kalebu loro mandeg pungkasan).basa) kodon kayata AA utawa GA kanggo ngidini plasmid rekombinan kanggo nyebut protein sing diwenehi label).Urutan primer kadhaptar ing Tabel 1 lan disintesis dening Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Target padha digedhèkaké nggunakake Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) utawa Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) nggunakake disiapake G. duodenalis cDNA minangka cithakan.Plasmid vektor ekspresi eukariotik pcDNA3.1(+) dilinearisasi karo enzim restriksi EcoRV lan defosforilasi nggunakake Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Fragmen pcDNA3.1(+) linierisasi lan fragmen gen target sing digedhekake diresiki nggunakake kit pemurnian gel DNA (Tiangen) lan diukur nggunakake Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragmen pcDNA3.1(+) lan saben fragmen gen target digabung maneh nggunakake campuran kloning rakitan tunggal MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) lan dikonfirmasi kanthi urutan DNA nggunakake Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Plasmid bebas endotoksin pcDNA3.1(+)-alpha-2 lan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 digawe nggunakake Kit Mini Plasmid tanpa Endotoksin SanPrep (Sangon Biotech).Konsentrasi dijaga ing ndhuwur 500 ng / µl kanggo mesthekake yen EDTA ing buffer elusi ora ngganggu tes transfeksi.Makrofag peritoneal tikus primer dibudidayakan ing piring 6 sumur kanthi medium RPMI 1640 lengkap (Industri Biologi) suwene 12 jam, banjur sel kasebut dikumbah kaping 3 ing PBS anget kanggo mbusak penisilin lan streptomisin, banjur ing medium ditambah karo medium lengkap.Plasmid bebas endotoksin pcDNA3.1(+)-alpha-2 lan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) diencerake ing 125 μl medium serum suda Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Banjur 5 µl reagen transfeksi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) diencerake ing 125 µl medium Opti-MEM serum rendah.Siapke kompleks liposom-DNA kanthi nyampur plasmid bebas endotoksin sing diencerke karo Lipofectamine 2000 lan ngidini campuran kasebut ngadeg ing suhu kamar suwene 5 menit.Transfer komplek kanthi kapisah menyang sel ing saben sumur lan aduk alon-alon.Sawise 4 jam, media kultur sel diganti karo 2 ml medium RPMI 1640 lengkap lan kultur diterusake 24 jam.Media kultur sel seger ditambahake ing sel lan diinkubasi kanggo macem-macem titik wektu gumantung saka desain assay.
Sampel protein saka supernatan lan lisat sel disiapake kaya sing diterangake sadurunge [25].Parameter transfer membran kanggo pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, lan His-tag yaiku 200 mA / 90 min.Kanggo interleukin 1β (IL-1β; Sistem R&D, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Swiss) lan NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Swiss) lan 1:5000 nargetake tag dheweke (Amylet Scientific, Wuhan, China) lan β-actin (Proteintech, Wuhan, China).
Cross-linking karo disuccinimide suberate (DSS) ditindakake kaya sing diterangake sadurunge [26].Sel dikumbah kaping telu nganggo PBS kadhemen lan dilisisake kanthi jarum 27 gauge ing buffer reaksi ASC 50 µl (pH 8.0) sing ngemot 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES lan 125 mM NaHCO3.Campuran disentrifugasi ing 5000 g suwene 3 menit lan pelet dijahit nganggo 10 µl DSS (25 mM ing DMSO) lan 40 µl buffer reaksi ASC suwene 30 menit ing 37 ° C.Sawise sentrifugasi ing 5000 g suwene 10 menit, pelet dibubarake ing larutan 40 µl buffer reaksi ASC lan 10 µl buffer loading protein 6x (TransGen, Beijing, China), banjur solusi kasebut dipateni ing suhu kamar kanggo 15 min., Banjur godhok 10 menit.Sampel protein banjur ditindakake Western blotting nggunakake antibodi anti-ASC primer (Wanleibio, Shenyang, China) kanthi rasio pengenceran 1:500.
Sawise prosedur sing diterangake sadurunge [13], supernatan kultur sel dipanen lan sekresi sitokin pro-inflamasi IL-1β ditemtokake nggunakake kit IL-1 Beta ELISA mouse (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Ngonversi nilai OD450nm dadi konsentrasi protein nggunakake kurva standar IL-1β.
Sel sing dilapisi ing tutup tutup dikumbah kaping telu ing PBS sing anget, dipasang ing fiksatif sel jaringan (Biosharp, Beijing, China) suwene 10 menit ing suhu kamar (RT), ing 0,1% Triton X-Permeabilize ing 100 (diencerke ing PBS; Biosharp). ) kanggo 20 menit ing suhu kamar lan blok ing 5% serum albumin sapi (ing PBS) kanggo 2 jam ing suhu kamar.Sel banjur diinkubasi sewengi ing suhu 4 ° C kanthi antibodi utama marang ASC (pengenceran 1:100) utawa NLRP3 (pengenceran 1:100), lan IgG (H+L) wedhus berlabel Cy3 (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, USA) utawa FITC-conjugated wedhus anti-mouse IgG (1:400; Earthox) sewengi ing 37 ° C ing peteng kanggo 1 jam.Inti kasebut diwarnai karo Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, Suzhou, China) suwene 5 menit lan diamati ing mikroskop fluoresensi (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang).
Tikus dipérang dadi patang klompok (n = 7 ing saben klompok): (i) Klompok kontrol negatif sing diobati PBS (mung PBS; gavage 100 μl / mouse PBS diikuti dening injeksi intraperitoneal saben dina 100 μl / mouse PBS 3 jam mengko) ., terus-terusan nganti 7 dina);(ii) klompok kontrol negatif sing diobati karo inhibitor MCC950 [27] (100 µl / mouse liwat gavage PBS, 3 jam mengko, 10 mg / kg bobot awak [BW] MCC950 [ing PBS] diterbitake intraperitoneally saben dina, durasi 7 dina);(iii) Klompok infeksi kista G. duodenalis (1,5 x 106 kista / mouse kanthi gavage, 3 jam mengko, 100 μl / mouse PBS intraperitoneally diterbitake saben dina kanggo 7 dina);(iv) G. duodenalis cyst digabungake klompok infèksi MCC950 inhibitor klompok perawatan (1,5 × 106 cysts / mouse liwat gavage, 10mg / kg bobot awak MCC950 intraperitoneally saben dina kanggo 7 dina ing 3h).Bobot awak saben tikus dipantau saben dina lan kabeh tikus diuripake ing dina kaping 7.Duodenum sing dipanen (dawa 3 cm) dipotong dadi potongan cilik ing 1 ml PBS, kista dirusak sewengi ing PBS ing 4 ° C, lan G. duodenalis trophozoites.Duodenum seger (dawa 1 cm) diisolasi kanggo pewarnaan hematoxylin lan eosin (H&E).
Tikus dipérang dadi rong klompok: (i) klompok kontrol MOCK lan (ii) klompok inhibitor MCC950.Ana limang perawatan ing saben klompok (n = 7 / klompok perawatan): (i) PBS grup kontrol negatif (PBS mung; 100 µl / mouse PBS, injeksi intramuskular (IM) (tibialis anterior) [28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) kelompok kontrol negatif plasmid (100 µg / DNA tikus, liwat injeksi intramuskular); klompok sing diobati karo plasmid pcDNA3.1 (+) -alpha-2 (100 μg / DNA tikus, kanthi injeksi intramuskular), lan (v) klompok sing diobati karo plasmid pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 (100 μg / mouse DNA, sawise 12 jam, tikus ing grup inhibitor MCC950 nampa injeksi intraperitoneal saben dina saka MCC950 (10 mg / kg bobot awak) kanggo 7 dina, nalika tikus ing grup MOCK nampa volume sing padha karo perawatan PBS. Sampel getih padha diklumpukake saka tikus eyeballs lan ditinggalake sewengi ing 4 ° C Sampel Serum diisolasi nggunakake enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) kanggo lan pangukuran tingkat IL-1β.
Telung puluh lima tikus dipérang dadi limang klompok (n = 7 / klompok).Grup 1 minangka klompok kontrol negatif sing diobati karo PBS: tikus nampa 100 μl PBS intramuskular lan 3 dina sabanjure kanthi gavage.Grup 2 minangka klompok kontrol positif sing kena infeksi kista G. duodenalis: tikus disuntikake kanthi 100 μl PBS, lan 3 dina sabanjure 1,5 x 106 kista / tikus disuntikake intragastrikal.Klompok katelu - imunisasi plasmid kanthi pcDNA3.1 (+) kanthi kombinasi karo klompok kontrol kanggo infeksi kista duodenum: tikus nampa 100 μg DNA plasmid pcDNA3.1 (+) (im) kanthi lisan, 1.5 × 106 kista / mouse 3 kanggo sawetara dina.Kelompok 4 lan 5 yaiku plasmid giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-2 rekombinan utawa pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine plasmid ing kombinasi karo infeksi kista G. duodenalis.Klompok eksperimen: tikus nampa 100 µg pcDNA3.1 (+) -giardine plasmid DNA (im), banjur 3 dina sabanjure, 1,5 × 106 kista / mouse disuntikake liwat gavage.Bobot awak saben tikus dipantau sawise introduksi kista G. duodenalis liwat tabung.Duodenum seger diklumpukake kanggo pangukuran beban parasit lan analisis pewarnaan HE.
Owah-owahan histopatologis dianalisis miturut prosedur sing diterbitake sadurunge [30].Duodenum seger didandani kanthi fiksatif sel jaringan, dilebokake ing parafin, dipotong dadi bagean 4 μm, diwarnai karo H&E lan dianalisis ing mikroskop cahya.Owah-owahan patologis perwakilan ing pitung bagean jaringan saka pitung tikus independen dievaluasi dening ahli patologi sing ora ngerti babagan perawatan kasebut lan dijupuk kanthi pembesaran 200x.Dawa villi lan ambane crypts diukur miturut cara sing diterangake sadurunge.
Asil in vitro lan in vivo dipikolehi ing rangkap tiga.Grafik digawe nggunakake GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Bedane antarane rong klompok dianalisis kanthi t-test, dene beda antarane ≥3 kelompok dianalisis kanthi analisis varian siji arah (ANOVA) nggunakake piranti lunak SPSS (versi 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Data dianalisis kanggo homogeneitas varian nggunakake uji Levene banjur uji post hoc Bonferroni (B).Signifikansi dituduhake minangka P<0,05, P<0,01, lan P<0,001 (ora signifikan [ns]) (P>0,05).
Analisis proteomik GEV sadurunge ing Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) nuduhake manawa akeh target bisa uga melu aktivasi jalur sinyal inflamasi [13].Kita milih loro target sing janjeni, alpha-2 lan alpha-7.3 giardins, nggedhekake molekul kasebut lan digunakake kanggo mbangun vektor ekspresi eukariotik pcDNA3.1(+).Sawise sequencing, rekombinan pcDNA3.1 (+) -alpha-2 lan alpha-7.3 plasmid ekspresi giardine ditransfeksi menyang makrofag peritoneal mouse utama, lan protein teken caspase-1 p20 inflamasi (fragmen saka caspase-1 sing diaktifake) diidentifikasi. minangka elucidating molekul kunci sing bisa micu inflammation.Asil nuduhake yen alpha-2 lan alpha-7.3 giardine bisa nyebabake ekspresi p20 caspase-1 sing padha karo GEV.Ora ana efek ing aktivasi caspase-1 ditemokake ing kontrol negatif sing ora ditambani (mung PBS) lan kontrol plasmid pcDNA3.1 (+) (Gambar 1).
Pangukuran aktivasi p20 caspase-1 dening pcDNA3.1 (+) -alpha-2 lan alpha-7.3 giardins.Plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1 (+) -alpha-2 lan alpha-7.3 giardines (ing ndhuwur saben jalur) ditransfeksi menyang makrofag peritoneal tikus primer lan supernatan kultur dipanen 24 jam sabanjure.Western blotting digunakake kanggo ngukur tingkat ekspresi saka protein inflammasome caspase-1 p20 teken.Klompok perawatan mung PBS (jalur C) lan klompok monoterapi pcDNA3.1 (+) (jalur pcDNA3.1) digunakake minangka kontrol negatif, lan klompok perawatan GEV digunakake minangka kontrol positif.Ekspresi protein rekombinan dikonfirmasi kanthi ndeteksi tag histidine ing saben protein, lan pita protein sing dikarepake yaiku alpha-2 giardine (38.2 kDa) lan alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum vesikel ekstraseluler, pcDNA3.1(+), vektor EcoRV-linearized, SUP, supernatan
Kanggo nemtokake manawa alpha-2 giardine lan alpha-7.3 giardine ngindhuksi ekspresi p20 caspase-1 lan nduweni peran kanggo ngaktifake respon inflamasi NLRP3 host, pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine lan pcDNA3.1 (+) -alpha -7.3 giardin ditransfeksi menyang makrofag peritoneal tikus utama kanthi DNA plasmid rekombinan, lan tingkat ekspresi, lokalisasi, lan oligomerisasi protein inflamasi kunci NLRP3 ditemtokake.Ing eksperimen iki, GEV digunakake minangka klompok kontrol positif, lan klompok tanpa perawatan (PBS mung) utawa pcDNA3.1 (+) klompok perawatan transfeksi minangka klompok negatif.Asil nuduhake yen, kaya ing grup GEV, DNA plasmid rekombinan saka giardin pcDNA3.1 (+) -alpha-2 lan giardin pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 ngasilake upregulation saka NLRP3, pro-IL-1β lan aktivasi procaspase-1 lan caspase-1 (Fig. 2a).Kajaba iku, loro giardine nyebabake sekresi IL-1β sing signifikan (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P <0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Gambar 2b).Umume protein ASC monomer ing klompok tanpa perawatan utawa ing klompok perawatan sing ditransfeksi karo pcDNA3.1 (+) plasmid, beda karo pcDNA3.1 (+) -alpha-2 utawa pcDNA3.1 (+) -alpha- 7.3 giardine.Oligomerisasi ASC dumadi ing DNA plasmid rekombinan saka klompok kontrol positif GEV utawa klompok, nuduhake wangun oligomer (Gambar 2c).Data awal kasebut nuduhake yen alpha-2 giardine lan alpha-7,3 giardine bisa nyebabake aktivasi inflamasi NLRP3.Pasinaon immunofluorescent sakteruse saka lokalisasi ASC lan NLRP3 nuduhake yen ing grup kontrol negatif, protein ASC kasebar ing saindhenging sitoplasma lan katon minangka sinyal titik nalika stimulasi pcDNA3.1 (+) -alpha-2 karo giardine utawa pcDNA3.1 (+) -alpha-7,3 klompok giardine utawa klompok kontrol positif GEV (Gambar 2d).Ing kontrol negatif lan kelompok pcDNA 3.1 sing diobati plasmid, sinyal protein NLRP3 ora dideteksi, dene titik sinyal neon kanggo nanggepi pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine utawa pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 dideteksi..giardine ditemokake ing sitoplasma utawa nalika stimulasi HEV (Gambar 2e).Data kasebut luwih nuduhake yen G. duodenalis giardin alpha-2 lan giardin alpha-7.3 ngaktifake inflammasome NLRP3 ing makrofag peritoneal utama tikus.
pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardin lan pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardin ngaktifake inflammasome NLRP3 ing makrofag peritoneal mouse.Transfeksi plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin lan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin menyang makrofag peritoneal murine primer lan sel, utawa panen supernatan sajrone 24 jam kanggo analisis ekspresi, oligomerisasi , sekresi.lan lokalisasi protein inflamasi kunci.Klompok PBS-only (C) lan klompok perawatan tunggal pcDNA3.1 (+) digunakake minangka kontrol negatif, lan klompok perawatan GEV digunakake minangka klompok positif.Protein inflamasi kunci NLRP3, kalebu NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, lan p20 caspase-1, dideteksi dening Western blotting.b Tingkat sekresi IL-1β ing supernatan ditemtokake nggunakake enzim-linked immunosorbent assay (ELISA).Bedane antarane klompok kontrol lan eksperimen dianalisis kanthi analisis varian siji arah (ANOVA) nggunakake piranti lunak SPSS versi 22.0.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan antarane klompok ** P <0,01 lan *** P <0,001.c Tingkat oligomerisasi ASC ing pelet ditemtokake dening analisis cross-linking DSS, nalika tingkat ASC ing lysates sel digunakake minangka kontrol loading.d Visualisasi lokalisasi ISC nggunakake immunofluorescence.e Immunofluorescence digunakake kanggo nggambarake lokalisasi NLRP3.ASC, protein kaya bintik apoptosis;IL, interleukin;NLRP3, reseptor kaya oligomerisasi sing ngiket nukleotida 3;ns, ora signifikan (P > 0,05)
Loro-lorone G. duodenalis lan GEV sing disekresi ngaktifake inflammasome NLRP3 lan ngatur respon inflamasi host in vitro.Mangkono, peran inflammasome NLRP3 ing patogenisitas G. duodenalis tetep ora jelas.Kanggo neliti masalah iki, kita ngrancang eksperimen antarane tikus sing kena infeksi kista G. duodenalis lan tikus sing kena infeksi kista G. duodenalis + perawatan inhibitor MCC950 lan mbandhingake ekspresi inflammasome NLRP3 nalika kena infeksi kista G. duodenalis.Skema rinci eksperimen ditampilake ing Fig. 3a.Owah-owahan bobot awak tikus ing kelompok perawatan sing beda-beda dipantau sajrone 7 dina sawise infeksi kista, lan asil ditampilake ing Gambar 3b.Dibandhingake karo klompok sing diobati karo PBS murni, asil kasebut nuduhake yen (i) bobot awak tikus sing kena infeksi kista G. duodenalis mudhun saka dina 3 nganti dina 7 sawise infeksi;(ii) perawatan karo inhibitor MCC950 ora duwe pengaruh sing signifikan marang bobot awak tikus..Dibandhingake karo klompok infeksi tunggal, BW saka klompok infeksi duodenal sing diobati karo MCC950 mudhun nganti derajat sing beda-beda (Dina 1: ANOVA, F (3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Dina 2: ANOVA, F (3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; Dina 6: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175;Data kasebut nuduhake yen inflammasome NLRP3 nglindhungi tikus saka mundhut bobot sing signifikan ing tahap awal (2-4 dina) infeksi duodenum.Kita banjur ngarahake kanggo ndeteksi G. duodenalis trophozoites ing cairan lavage duodenal lan asil ditampilake ing Figure 3c.Dibandhingake karo klompok infèksi kista G. duodenalis, jumlah trofozoit ing duodenum mundhak sacara signifikan sawise mblokir inflammasome NLRP3 (t (12) = 2,902, P = 0,0133).Jaringan duodenum sing diwarnai HE nuduhake, dibandhingake karo kontrol negatif sing diobati karo PBS lan MCC950 mung: (i) Infeksi kista G. duodenalis nyebabake karusakan ing villi duodenal (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) lan atrofi crypt (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum saka tikus sing kena infeksi kista G. duodenalis lan diobati karo inhibitor MCC950.villi duodenal rusak lan mati (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) kanthi atrofi lan cabang crypt (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f).Asil kasebut nuduhake yen inflammasome NLRP3 nduweni peran kanggo ngurangi patogenisitas G. duodenalis.
Peran inflammasome NLRP3 ing infeksi Giardia duodenum.Tikus digavaged (iv) karo kista duodenokokus lan banjur diobati nganggo utawa tanpa MCC950 (ip).Kelompok perawatan tunggal karo PBS utawa MCC950 digunakake minangka kontrol.Kelompok eksperimen lan regimen perawatan.b Bobot awak tikus ing saben macem-macem kelompok perawatan dipantau suwene 7 dina.Bedane antarane klompok infeksi G. duodenalis lan klompok perawatan infeksi G. duodenalis + MCC950 dianalisis kanthi t-test nggunakake piranti lunak SPSS versi 22.0.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan ing * P <0.05, ** P <0.01, utawa *** P <0.001.c. Beban parasit ditemtokake kanthi ngitung jumlah trofozoit ing cairan lavage duodenal.Bedane antarane klompok infeksi G. duodenalis lan klompok perawatan infeksi G. duodenalis + MCC950 dianalisis kanthi t-test nggunakake piranti lunak SPSS versi 22.0.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan ing * P <0,05.d Hasil pewarnaan hematoksilin lan eosin (H&E) saka histopatologi duodenum.Panah abang nuduhake karusakan ing villi, panah ijo nuduhake karusakan ing crypts.Skala bar: 100 µm.e, f Analisis statistik saka dhuwur villus duodenal lan dhuwur crypt mouse.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan ing * P <0,05 lan ** P <0,01.Asil dijupuk saka 7 eksperimen biologi independen.BW, bobot awak;ig, rute pangiriman intragastric;ip, rute pangiriman intraperitoneal;ns, ora signifikan (P> 0,05);PBS, saline buffered fosfat;WT, jinis liar
Sekresi IL-1β minangka ciri saka aktivasi inflamasi.Kanggo nemtokake manawa G. duodenalis alpha-2 giardine lan alpha-7.3 giardine ngaktifake inflammasome inang NLRP3 ing vivo, kita nggunakake tikus WT sing ora diobati (grup palsu) lan tikus sing diblokir inflammasome NLRP3 (kelompok perawatan nyegah MCC950).Skema rinci eksperimen ditampilake ing Fig. 4a.Klompok eksperimen kalebu tikus sing diobati karo PBS, perawatan kista G. duodenalis kanthi gavage, injeksi intramuskular pcDNA3.1, lan injeksi intramuskular pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine utawa pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Ing dina kaping 7 sawise administrasi intramuskular plasmid rekombinan, serum diklumpukake lan tingkat IL-1β ing saben klompok ditemtokake.Kaya sing ditampilake ing Gambar 4b, ing klompok MOCK: (i) dibandhingake karo klompok PBS, perawatan pcDNA3.1 ora duwe pengaruh sing signifikan marang sekresi IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), nanging, Sekresi IL-β mundhak sacara signifikan ing grup kista G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine lan pcDNA3.1- Injeksi intramuskular alpha-7.3 giardine kanthi signifikan ningkatake tingkat IL-1β serum (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine nyebabake sekresi IL-1β sing dhuwur ing grup injeksi intramuskular giardine pcDNA3.1-alpha-2 (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Dibandhingake karo saben klompok ing grup perawatan MCC950 lan klompok MOCK: (i) tingkat sekresi IL-1β ing grup kontrol PBS lan grup kontrol pcDNA3.1 mudhun nganti sawetara sawise mblokir inhibitor MCC950, nanging bedane ora. pinunjul (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) sawise mblokir MCC950., Sekresi IL-1β dikurangi sacara signifikan ing klompok sing kena infeksi kista G. duodenalis, grup giardine pcDNA3.1-alpha-2, lan grup giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9). , 58) = 3,540, P = 0,0120; ) = 3,540, P = 0,0164).Asil kasebut nuduhake yen alpha-2 giardine lan alpha-7.3 giardine mediasi aktivasi inflammasome NLRP3 ing vivo.
pcDNA3.1 (+) -giardine ngaktifake inflammasome inang NLRP3 ing vivo.Tikus diimunisasi (IM) kanthi ekspresi eukariotik rekombinan plasmid pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine utawa pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine lan banjur diobati nganggo MCC950 (ip; grup MCC950) utawa ora (grup goblok). ).Kelompok perawatan plasmid PBS utawa pcDNA3.1 (+) digunakake minangka kontrol negatif, klompok perawatan kista G. duodenalis digunakake minangka kontrol positif.Kelompok eksperimen lan regimen perawatan.b Tingkat serum IL-1β ing tikus diukur ing dina 7 kanthi uji ELISA.Bedane antarane klompok ing grup MOCK dianalisis nggunakake ANOVA siji-arah, lan beda antarane klompok MOCK lan klompok MCC950 dianalisis nggunakake t-test saka piranti lunak SPSS versi 22.0.Asterisk nuduhake beda sing signifikan antarane kelompok perawatan ing grup MOCK, * P <0.05 lan *** P <0.001;pratandha dollar ($) nuduhake beda pinunjul antarane saben klompok ing grup MOCK lan klompok MCC950 ing P <0,05.Asil saka pitung eksperimen biologi independen.i, injeksi intramuskular, ns, ora signifikan (P> 0,05)
Kanggo neliti efek alpha-2 lan alpha-7.3 giardine-mediated aktivasi saka NLRP3 host inflammasome ing G. duodenalis infectivity, kita nggunakake WT C57BL / 6 tikus lan nyuntikaken alpha-2 giardine lan alpha-7.3 giardine.plasmid disuntikake intramuskular, sawise 3 dina liwat tabung lambung saka kista G. duodenalis, sawise tikus kasebut diamati sajrone 7 dina.Skema rinci eksperimen ditampilake ing Fig. 5a.Bobot awak saben tikus diukur saben dina, conto jaringan duodenal seger diklumpukake ing dina kaping 7 sawise administrasi liwat tabung lambung, jumlah trofozoit diukur, lan owah-owahan histopatologi diamati.Kaya sing dituduhake ing Gambar 5b, kanthi nambah wektu pakan, BW tikus ing saben klompok saya mundhak.MT tikus wiwit nyuda ing dina kaping 3 sawise administrasi intragastric kista G. duodenalis, lan banjur mundhak kanthi bertahap.Aktivasi inflammasome NLRP3 sing disebabake dening injeksi intramuskular alpha-2 giardine lan alpha7.3 giardine kanthi signifikan nyuda bobot awak ing tikus (Dina 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Dina 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Dina 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Dina 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dina 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083; Dina 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dina 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Dina 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Dina 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Dina 6: pcDNA3. alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Dina 6: pcDNA3,1-alpha-7,3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dina 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Dina 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0,0001).Beban parasit ditaksir ing duodenum (Gambar 5c).Dibandhingake karo kontrol positif sing ora diobati lan klompok sing disuntikake karo vektor pcDNA3.1 kosong, jumlah trophozoit G. duodenalis dikurangi sacara signifikan ing kelompok sing disuntikake karo α-2 giardine lan α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Kajaba iku, giardine alfa-7.3 luwih protèktif ing tikus tinimbang giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Hasil pewarnaan HE ditunjukkan pada gambar.5d–f.Tikus sing disuntikake karo alpha-2 giardine lan alpha-7.3 giardine nduweni lesi jaringan duodenal sing luwih sithik, diwujudake kanthi karusakan villus, dibandhingake karo tikus sing disuntikake G. duodenalis lan tikus sing disuntikake karo G. duodenalis kanthi kombinasi vektor pcDNA3 kosong .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 utawa P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 utawa P = 0.0055) lan nyuda atrofi crypt (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 utawa P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 utawa P = 0,0191).Asil kasebut nuduhake yen alpha-2 giardine lan alpha-7,3 giardine nyuda infektivitas G. duodenalis kanthi ngaktifake inflammasome NLRP3 ing vivo.
Peran pcDNA3.1 (+) -giardins ing infèksi G. duodenalis.Tikus diimunisasi (IM) karo plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine utawa pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine lan banjur ditantang karo kista G. duodenalis (ig).Klompok PBS lan klompok perawatan kista pcDNA3.1 (+) + duodenal digunakake minangka kelompok kontrol negatif, lan klompok perawatan kista duodenum digunakake minangka grup kontrol positif.Kelompok eksperimen lan regimen perawatan.b MT tikus ing saben macem-macem kelompok perawatan dipantau sajrone 7 dina sawise tantangan.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan antarane klompok ing grup G. duodenalis lan grup giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-2, * P <0.05, ** P <0.01, lan *** P <0.001;tandha dollar ($) nuduhake prabédan pinunjul antarane saben klompok G. duodenalis lan pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 grup jardine, $$ P <0,01 lan $$$ P <0,001.c Beban parasit ditemtokake kanthi ngitung jumlah trofozoit ing 1 ml lavage duodenal saka duodenum (dawa 3 cm) lan dituduhake minangka jumlah parasit saben cm duodenum.Bedane antarane klompok infeksi G. duodenalis, klompok giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-2, lan klompok giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 dianalisis kanthi ANOVA siji-arah nggunakake piranti lunak SPSS versi 22.0.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan ing ** P <0.01 lan *** P <0.001.d Owah-owahan histopatologi ing duodenum.Panah abang nuduhake karusakan ing villi, panah ijo nuduhake karusakan ing crypts.Skala bar: 100 µm.e, f Analisis statistik dhuwur vili duodenal mouse (e) lan dhuwur crypt (f).Bedane antarane klompok ing Gambar 1d dianalisis kanthi ANOVA siji-arah nggunakake piranti lunak SPSS versi 22.0.Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan ing * P <0,05 lan ** P <0,01.Asil saka pitung eksperimen biologi independen.ns, ora signifikan (P > 0,05)
Giardia duodenum minangka parasit usus sing kondhang ing manungsa lan mamalia liyane sing nyebabake giardiasis.Ing taun 2004, iki kalebu ing WHO Neglected Diseases Initiative amarga prevalensi dhuwure luwih saka 6 taun, utamane ing komunitas sing status sosial ekonomi kurang [32].Sistem kekebalan bawaan nduweni peran kritis ing respon imun kanggo infeksi G. duodenalis.Makrofag tikus wis dilapurake kanggo ngulu lan mateni G. duodenalis kanthi ngeculake jebakan ekstraseluler [33].Panaliten sadurunge wis nuduhake yen G. duodenalis, parasit ekstraselular non-invasif, ngaktifake p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, lan jalur sinyal inflamasi NLRP3 ing makrofag mouse kanggo ngatur respon inflamasi host, lan GEV sing dirilis bisa ningkatake proses iki.13], 24].Nanging, PAMP sing tepat sing ana ing inflamasi sing diatur inflammasome NLRP3 ing GEV lan peran inflammasome NLRP3 ing giardiasis tetep dijlentrehake.Kanggo njlentrehake rong pitakonan kasebut, kita nindakake panliten iki.
Inflammasom NLRP3 dumunung ing sitoplasma sel imun lan bisa diaktifake dening macem-macem partikel kayata kristal asam urat, racun, bakteri, virus, lan parasit.Ing studi bakteri, racun wis diidentifikasi minangka PAMP kunci sing ngaktifake sensor inflamasi, nyebabake inflamasi lan pati sel [34].Sawetara racun kanthi struktural, kayata hemolysin saka Staphylococcus aureus [35] lan Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) saka enterotoxin (NHE) [37], nyebabake aktivasi inflamasi NLRP3.Panaliten virus nuduhake yen protein virulensi kayata protein envelope (E) SARS-COV-2 [38] lan protein NS5 virus Zika [39] minangka PAMP penting sing diakoni dening reseptor NLRP3.Ing studi parasit, akeh parasit wis dilapurake ana hubungane karo aktivasi inflammasome inang, kayata Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], lan Leishmania [42].Protein granula padhet GRA35, GRA42, lan GRA43, sing ana gandhengane karo virulensi Toxoplasma gondii, dibutuhake kanggo induksi pyroptosis ing makrofag tikus Lewis [43].Kajaba iku, sawetara studi Leishmania wis fokus ing molekul individu sing melu ing inflammasome NLRP3, kayata lipophosphoglycan membran parasit [44] utawa metalloprotease seng [45].Antarane kulawarga alpha-giardin annexin-kaya gen, alpha-1 giardin wis ditampilake minangka calon vaksin potensial menehi pangayoman marang G. duodenalis ing model mouse [18].Ing panliten kita, kita milih faktor virulensi G. duodenalis alpha-2 lan alpha-7,3 giardines, sing unik kanggo giardia nanging relatif kurang dilaporake.Loro gen target iki dikloning menyang vektor sistem ekspresi eukariotik pcDNA3.1 (+) kanggo analisis aktivasi inflamasi.
Ing model mouse kita, pecahan caspase sing dibelah dadi tandha aktivasi inflamasi.Sawise stimulasi, NLRP3 sesambungan karo ASC, njupuk procaspases, lan ngasilake caspases aktif sing mecah pro-IL-1β lan pro-IL-18 dadi IL-1β lan IL-18 diwasa, masing-masing -18.Caspases inflamasi (caspases-1, -4, -5 lan -11) minangka kulawarga protease sistein sing dikonservasi sing penting kanggo pertahanan bawaan lan melu inflamasi lan pati sel sing diprogram [46].Caspase-1 diaktifake dening inflammasom kanonik [47], nalika caspases-4, -5, lan -11 dipecah nalika pembentukan inflammasom atipikal [48].Ing panliten iki, kita nggunakake makrofag peritoneal mouse minangka model lan nyelidiki p20 caspase-1 cleaved caspase-1 minangka penanda aktivasi inflamasi NLRP3 host ing studi infeksi G. duodenalis.Asil kasebut nuduhake manawa akeh alpha-giardin sing tanggung jawab kanggo aktivasi inflamasi sing khas, sing konsisten karo panemuan molekul virulensi kunci sing ana ing bakteri lan virus.Nanging, panliten kita mung minangka layar awal lan ana molekul liyane sing bisa ngaktifake inflammasom non-klasik, amarga panliten sadurunge nemokake inflammasom klasik lan non-klasik ing infeksi G. duodenalis [13].Kanggo luwih nemtokake manawa p20 caspase-1 sing diasilake digandhengake karo inflammasome NLRP3, kita nransfer giardins alpha-2 lan alpha-7.3 menyang makrofag peritoneal mouse kanggo nemtokake tingkat ekspresi protein molekul kunci lan tingkat oligomerisasi ASC, sing ngonfirmasi yen loro α-giardins ngaktifake. inflammasome NLRP3.Asil kita rada beda karo Manko-Prykhoda et al., sing nyatakake yen stimulasi sel Caco-2 kanthi galur G. muris utawa E. coli EPEC mung bisa nambah intensitas fluoresensi NLRP3, ASC, lan caspase-1, sanajan ora sacara signifikan, nalika kostimulasi G. muris lan E. coli nambah tingkat telung protein [49].Bedane iki bisa uga amarga beda pilihan spesies Giardia, garis sel, lan sel primer.Kita uga nindakake in vivo assays nggunakake MCC950 ing WT C57BL / 6 clurut wadon 5-minggu, kang luwih rentan kanggo G. duodenalis.MCC950 minangka inhibitor NLRP3 molekul cilik sing kuat lan selektif sing ngalangi aktivasi NLRP3 kanonik lan non-kanonik ing konsentrasi nanomolar.MCC950 nyegah aktivasi NLRP3 nanging ora mengaruhi aktivasi jalur inflamasi AIM2, NLRC4, lan NLRP1 utawa jalur sinyal TLR [27].MCC950 mblokir aktivasi NLRP3 nanging ora nyandhet wiwitan NLRP3, K+ efflux, Ca2+ influx, utawa interaksi antarane NLRP3 lan ASC;tinimbang, nyegah aktivasi inflammasome NLRP3 kanthi ngalangi oligomerisasi ASC [27].Mulane, kita nggunakake MCC950 ing studi in vivo kanggo nemtokake peran inflammasome NLRP3 sawise injeksi giardine.Caspase-1 p10 sing diaktifake ngilangi sitokin pro-inflamasi pro-IL-1β lan pro-IL-18 dadi IL-1β lan IL-18 diwasa [50].Ing panliten iki, tingkat serum IL-1β ing tikus sing diobati giardine kanthi utawa tanpa MCC950 digunakake minangka indikator yen inflammasom NLRP3 diaktifake.Kaya sing dikarepake, perawatan MCC950 nyuda tingkat IL-1β serum kanthi signifikan.Data kasebut kanthi jelas nuduhake yen G. duodenalis giardin alfa-2 lan giardin alfa-7.3 bisa ngaktifake inflammasome mouse NLRP3.
Data penting sing diklumpukake sajrone dekade kepungkur nuduhake yen IL-17A minangka regulator utama kekebalan marang G. muris, nyebabake sinyal IL-17RA, ngasilake peptida antimikroba, lan ngatur aktivasi komplemen [51].Nanging, infèksi Giardia luwih kerep dumadi ing wong diwasa enom, lan wis dilapurake yen infeksi Giardia ing tikus enom ora ngaktifake respon IL-17A kanggo ngleksanakake efek protèktif [52], sing ndadekake peneliti nggoleki Giardia imunomodulator liyane.mekanisme infèksi helminth.Penulis studi anyar nglaporake yen G. muris bisa ngaktifake inflammasome NLRP3 dening E. coli EPEC, sing ningkatake produksi peptida antimikroba lan nyuda kapasitas lampiran lan jumlah trofozoit ing saluran usus, saéngga nyuda keruwetan usus besar. penyakit sing disebabake bacilli [49].Inflammasom NLRP3 melu ngembangake macem-macem penyakit.Panaliten nuduhake manawa Pseudomonas aeruginosa nyebabake autophagy ing makrofag kanggo nyegah pati sel, lan proses iki gumantung marang aktivasi inflammasome NLRP3 [53].Kanggo N. caninum, aktivasi spesies oksigen reaktif saka inflammasome NLRP3 mbatesi replikasi ing host, dadi target terapeutik potensial [9].Paracoccidioides brasiliensis wis ditemokake kanggo ngindhuksi aktivasi inflammasome NLRP3 ing sel dendritik sing asale saka sumsum balung tikus, sing nyebabake pelepasan sitokin inflamasi IL-1β, sing nduweni peran kritis ing pertahanan inang [10].Sawetara spesies Leishmania, kalebu L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, lan L. infantum chagasi, ngaktifake NLRP3 lan ASC-dependent caspase-1 ing makrofag, uga infeksi Leishmania.Replikasi parasit ditingkatake ing tikus sing kurang ing gen NLRP3 / ASC / caspase-1 [11].Zamboni et al.Infeksi Leishmania wis dilapurake kanggo ngindhuksi aktivasi inflammasom NLRP3 ing makrofag, sing mbatesi replikasi parasit intraselular.Mangkono, Leishmania bisa nyandhet aktivasi NLRP3 minangka strategi panyegahan.Ing studi in vivo, inflammasome NLRP3 nyumbang kanggo ngilangi Leishmania, nanging ora mengaruhi jaringan [54].Kosok baline, ing studi helminthiasis, aktivasi inflammasome NLRP3 nyuda kekebalan protèktif host marang helminthiasis gastrointestinal [12].Shigella minangka salah sawijining bakteri utama sing nyebabake diare ing saindenging jagad.Bakteri iki bisa nyebabake produksi IL-1β liwat P2X7 reseptor-mediated K + efflux, spesies oksigen reaktif, acidification lisosom, lan karusakan mitokondria.Inflammasom NLRP3 sacara negatif ngatur fagositosis lan aktivitas bakterisida makrofag marang Shigella [55].Pasinaon Plasmodium nuduhake yen tikus kekurangan AIM2, NLRP3 utawa caspase-1 sing kena infeksi Plasmodium ngasilake interferon tipe 1 sing dhuwur lan luwih tahan infeksi Plasmodium [56].Nanging, peran alpha-2 giardine lan alpha-7.3 giardine ing ngindhuksi aktivasi patogen saka inflamasi NLRP3 ing tikus ora jelas.
Ing panliten iki, inhibisi inflammasome NLRP3 dening MCC950 nyuda BW lan nambah jumlah trofozoit ing cairan lavage usus ing tikus, nyebabake owah-owahan patologis sing luwih abot ing jaringan duodenum.Alpha-2 giardine lan alpha-7.3 giardine ngaktifake inflammasome mouse host NLRP3, nambah bobot awak mouse, ngurangi jumlah trofozoit ing cairan lavage usus, lan nyuda lesi duodenal patologis.Asil kasebut nuduhake yen G. duodenalis bisa ngaktifake inflammasome host NLRP3 liwat alpha-2 giardine lan alpha-7,3 giardine, ngurangi patogenisitas G. duodenalis ing tikus.
Secara kolektif, asil kita nduduhake yen alpha-2 lan alpha-7.3 giardines ngindhuksi aktivasi inflammasome host NLRP3 lan nyuda infektivitas G. duodenalis ing tikus.Mulane, molekul kasebut minangka target sing njanjeni kanggo nyegah giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: ringkesan.Iki bubar dicethakaké Pat Inflamm alergi kanggo obatan.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: review pharmacotherapy.Mratelakake panemume Ahli saka apoteker.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, resistensi obat lan panemuan target anyar.Nginfèksi target obat Disord.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, lsp. NLRP3 inflammasome lan penyakit inflamasi.Oksida Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Peran saka inflammasome ing inflamasi usus lan kanker.Gastroenterologi.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical lan aktivasi inflammasome NLRP3 atipikal ing persimpangan toleransi kekebalan lan inflamasi usus.pra-imun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Aktivasi inflammasome NLRP3 sing dimediasi ROS melu nanggepi infeksi N. caninum.Vektor parasit.2020;13:449.