Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Toxoplasma gondii minangka parasit protozoa intraselular sing modulasi lingkungan mikro saka host sing kena infeksi lan dikenal ana hubungane karo kedadeyan tumor otak.Ing panliten iki, kita nggawe hipotesis manawa miRNA-21 eksosomal saka infèksi Toxoplasma ningkatake pertumbuhan tumor otak.Eksosom saka mikroglia BV2 sing kena infeksi Toxoplasma ditondoi lan internalisasi sel glioma U87 dikonfirmasi.Profil ekspresi microRNA eksosomal dianalisis nggunakake susunan microRNA lan microRNA-21A-5p sing ana gandhengane karo Toxoplasma gondii lan ngurutake tumor.Kita uga nyelidiki tingkat mRNA gen sing gegandhengan karo tumor ing sel glioma U87 kanthi ngganti tingkat miR-21 ing exosom lan efek exosome ing proliferasi sel glioma U87 manungsa.Ing eksosom sel glioma U87 sing kena infeksi Toxoplasma gondii, ekspresi microRNA-21 tambah lan aktivitas gen antitumor (FoxO1, PTEN, lan PDCD4) dikurangi.Eksosom sing asale saka BV2 sing kena infeksi Toxoplasma nyebabake proliferasi sel glioma U87.Exosom nyebabake wutah sel U87 ing model tumor tikus.Kita suggest sing tambah exosomal miR-21 ing Toxoplasma-infèksi BV2 microglia bisa muter peran penting minangka promotor wutah sel ing U87 sel glioma dening downregulating gen antitumor.
Dikira-kira luwih saka 18.1 yuta kasus kanker lanjut didiagnosa ing saindenging jagad ing taun 2018, kanthi udakara 297.000 tumor sistem saraf pusat didiagnosis saben taun (1.6% saka kabeh tumor)1.Panaliten sadurunge nuduhake manawa faktor risiko ngembangake tumor otak manungsa kalebu macem-macem produk kimia, riwayat kulawarga, lan radiasi ionisasi saka peralatan terapeutik lan diagnostik sirah.Nanging, panyebab sing tepat saka ganas kasebut ora dingerteni.Kira-kira 20% saka kabeh kanker ing donya disebabake dening agen infèksius, kalebu virus, bakteri lan parasit3,4.Patogen infèksius ngganggu mekanisme genetik sel inang, kayata ndandani DNA lan siklus sel, lan bisa nyebabake inflamasi kronis lan ngrusak sistem kekebalan5.
Agen infèksi sing ana hubungane karo kanker manungsa minangka patogen virus sing paling umum, kalebu virus papilloma manungsa lan virus hepatitis B lan C.Parasit uga bisa duwe peran potensial ing pangembangan kanker manungsa.Sawetara spesies parasit, yaiku Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis lan Hymenolepis nana, wis kena pengaruh ing macem-macem jinis kanker manungsa 6,7,8.
Toxoplasma gondii minangka protozoa intraselular sing ngatur lingkungan mikro sel inang sing kena infeksi.Parasit iki dikira-kira bisa nginfèksi kira-kira 30% saka populasi donya, nyebabake kabeh populasi ing risiko9,10.Toxoplasma gondii bisa nginfèksi organ vital, kalebu sistem saraf pusat (CNS), lan nyebabake penyakit serius kayata meningitis lan encephalitis sing fatal, utamane ing pasien immunocompromised9.Nanging, Toxoplasma gondii uga bisa ngowahi lingkungan host sing kena infeksi kanthi modulasi pertumbuhan sel lan respon imun ing individu immunocompetent, sing ndadékaké pangopènan infeksi kronis asimtomatik9,11.Sing nggumunake, amarga ana hubungane antarane prevalensi T. gondii lan insiden tumor otak, sawetara laporan nuduhake yen ing vivo host owah-owahan lingkungan amarga infeksi T. gondii kronis meh padha karo lingkungan mikro tumor.
Eksosom dikenal minangka komunikator antarsel sing ngirim konten biologis, kalebu protein lan asam nukleat, saka sel tetanggan16,17.Eksosom bisa mengaruhi proses biologis sing gegandhengan karo tumor kayata anti-apoptosis, angiogenesis, lan metastasis ing lingkungan mikro tumor.Utamane, miRNAs (miRNAs), RNA non-coding cilik sing dawane udakara 22 nukleotida, minangka regulator gen pasca-transkripsi sing penting sing ngontrol luwih saka 30% mRNA manungsa liwat kompleks silencing sing diakibatake miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii bisa ngganggu proses biologis kanthi ngontrol ekspresi miRNA ing host sing kena infeksi.MiRNA inang ngemot sinyal penting kanggo ngatur proses biologi inang kanggo entuk strategi kaslametané parasit.Dadi, nyinaoni owah-owahan ing profil miRNA inang nalika infeksi karo T. gondii bisa mbantu kita ngerti interaksi antarane inang lan T. gondii kanthi luwih cetha.Pancen, Thirugnanam et al.15 nyaranake yen T. gondii ningkatake karsinogenesis otak kanthi ngowahi ekspresi ing miRNA host tartamtu sing ana hubungane karo pertumbuhan tumor lan nemokake yen T. gondii bisa nyebabake glioma ing kéwan eksperimen.
Panliten iki fokus marang owah-owahan miR-21 eksosomal ing mikroglia inang sing kena infeksi Toxoplasma BV2.Kita mirsani kemungkinan peran miR-21 exosomal sing diowahi ing pertumbuhan sel glioma U87 amarga retensi ing inti FoxO1 / p27, sing dadi target miR-21 sing overexpressed.
Eksosom sing asalé saka BV2 dipikolehi kanthi nggunakake sentrifugasi diferensial lan divalidasi kanthi macem-macem cara kanggo nyegah kontaminasi karo komponen seluler utawa vesikel liyane.SDS-polyacrylamide gel elektroforesis (SDS-PAGE) nuduhake pola béda antarane protein sing diekstrak saka sel BV2 lan exosomes (Figure 1A), lan conto padha kabiji kanggo ngarsane Alix, kang analisa dening Western blotting saka panandha protein exosomal ing.Labeling Alix ditemokake ing protein eksosom nanging ora ana ing protein lisat sel BV2 (Gambar 1B).Kajaba iku, RNA sing diresiki saka exosom sing asale saka BV2 dianalisis nggunakake bioanalyzer.Subunit ribosom 18S lan 28S jarang diamati ing pola migrasi RNA eksosomal, sing nuduhake kemurnian sing bisa dipercaya (Gambar 1C).Pungkasan, mikroskop elektron transmisi nuduhake yen eksosom sing diamati kira-kira ukurane 60-150 nm lan duwe struktur kaya cangkir sing khas saka morfologi eksosom (Gambar 1D).
Karakterisasi eksosom sing asale saka sel BV2.(A) Kaca lembar data safety.Protein diisolasi saka sel BV2 utawa eksosom sing asale saka BV2.Pola protein beda antarane sel lan eksosom.(B) Analisis Western blot saka panandha eksosomal (Alix).(C) Evaluasi RNA sing diresiki saka sel BV2 lan eksosom sing diturunake BV2 nggunakake bioanalyzer.Mangkono, subunit ribosom 18S lan 28S ing sel BV2 arang ditemokake ing RNA eksosomal.(D) Mikroskopi elektron transmisi nuduhake yen eksosom sing diisolasi saka sel BV2 diwarnai kanthi negatif karo uranil asetat 2%.Eksosom ukurane kira-kira 60-150 nm lan bentuke cangkir (Song lan Jung, data sing ora diterbitake).
Internalisasi seluler saka exosom sing asale saka BV2 menyang sel glioma manungsa U87 diamati nggunakake mikroskop confocal.Eksosom berlabel PKH26 dilokalisasi ing sitoplasma sel U87.Nukleus diwarnai karo DAPI (Gambar 2A), nuduhake yen eksosom sing asale saka BV2 bisa internalisasi dening sel inang lan mengaruhi lingkungan sel panampa.
Internalisasi eksosom sing diturunake BV2 menyang sel glioma U87 lan eksosom sing diturunake BV2 sing kena infeksi Toxoplasma RH sing nyebabake proliferasi sel glioma U87.(A) Eksosom sing dilebur dening sel U87 sing diukur nganggo mikroskop confocal.Sel glioma U87 diinkubasi kanthi eksosom sing dilabeli PKH26 (abang) utawa tanpa kontrol sajrone 24 jam.Inti kasebut diwarnai nganggo DAPI (biru) banjur diamati ing mikroskop confocal (bar skala: 10 μm, x 3000).(B) Proliferasi sel glioma U87 ditemtokake kanthi uji proliferasi sel.Sel glioma U87 diobati karo exosomes kanggo wektu sing dituduhake. *P <0,05 dipikolehi kanthi uji t Student. *P <0,05 dipikolehi kanthi uji t Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0,05 kanthi t-test Siswa. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 dipikolehi nggunakake uji t Student.
Sawise ngonfirmasi internalisasi exosom sing asale saka BV2 menyang sel glioma U87, kita nindakake tes proliferasi sel kanggo neliti peran exosom sing asale saka Toxoplasma BV2 ing pangembangan sel glioma manungsa.Perawatan sel U87 kanthi eksosom saka sel BV2 sing kena infeksi T. gondii nuduhake yen eksosom sing diturunake BV2 sing kena infeksi T. gondii nyebabake proliferasi sel U87 sing luwih dhuwur tinimbang kontrol (Gambar 2B).
Kajaba iku, wutah saka sel U118 duwe asil sing padha karo U87, amarga Toxoplasma stimulasi exosomes nyebabake tingkat proliferasi paling dhuwur (data ora ditampilake).Adhedhasar data kasebut, kita bisa nunjukake yen exosom sing kena infeksi Toxoplasma sing asale saka BV2 nduweni peran penting ing proliferasi sel glioma.
Kanggo neliti efek saka exosomes BV2 sing kena infeksi Toxoplasma ing perkembangan tumor, kita nyuntikake sel glioma U87 menyang tikus mudo kanggo model xenograft lan nyuntikake exosom sing asalé saka BV2 utawa exosom sing asalé saka BV2 sing kena infeksi RH.Sawise tumor katon sawise 1 minggu, saben klompok eksperimen 5 tikus dibagi miturut ukuran tumor kanggo nemtokake titik wiwitan sing padha, lan ukuran tumor diukur sajrone 22 dina.
Ing tikus kanthi model xenograft U87, ukuran tumor sing luwih gedhe lan bobote diamati ing grup eksosom sing kena infeksi RH sing diturunake BV2 ing dina 22 (Gambar 3A, B).Ing sisih liya, ora ana prabédan sing signifikan ing ukuran tumor ing antarane klompok exosome sing asale saka BV2 lan klompok kontrol sawise perawatan exosome.Kajaba iku, tikus sing disuntik karo sel glioma lan eksosom kanthi visual nampilake volume tumor paling gedhe ing klompok eksosom sing diturunake BV2 sing kena infeksi RH (Gambar 3C).Asil kasebut nuduhake yen exosom sing kena infeksi Toxoplasma sing asale saka BV2 nyebabake pertumbuhan glioma ing model tumor tikus.
Onkogenesis (AC) saka exosomes asale BV2 ing model mouse xenograft U87.Ukuran tumor (A) lan bobot (B) tambah akeh ing tikus mudo BALB / c sing diobati karo exosomes sing kena infeksi RH sing asale saka BV2.BALB / c tikus mudo (C) disuntikake subkutan kanthi 1 x 107 sel U87 sing digantung ing campuran Matrigel.Enem dina sawise injeksi, 100 μg exosomes sing asale saka BV2 diobati ing tikus.Ukuran lan bobot tumor diukur ing dina sing dituduhake lan sawise kurban. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Data kasebut nuduhake yen 37 miRNAs (16 overexpressed lan 21 downexpressed) sing digandhengake karo kakebalan utawa perkembangan tumor diowahi sacara signifikan ing microglia sawise infeksi karo galur Toxoplasma RH (Gambar 4A).Tingkat ekspresi relatif miR-21 ing antarane miRNA sing diowahi dikonfirmasi dening RT-PCR wektu nyata ing exosom sing asale saka BV2, exosom sing diobati karo sel BV2 lan U87.Ekspresi miR-21 nuduhake paningkatan eksosom sing signifikan saka sel BV2 sing kena infeksi Toxoplasma gondii (galur RH) (Gambar 4B).Tingkat ekspresi relatif miR-21 ing sel BV2 lan U87 mundhak sawise njupuk exosom sing diowahi (Gambar 4B).Tingkat relatif ekspresi miR-21 ing jaringan otak pasien tumor lan tikus sing kena infeksi Toxoplasma gondii (galur ME49) luwih dhuwur tinimbang kontrol (Gambar 4C).Asil kasebut ana hubungane karo beda antarane tingkat ekspresi mikroRNA sing diprediksi lan dikonfirmasi in vitro lan in vivo.
Owah-owahan ing ekspresi exosomal miP-21a-5p ing mikroglia sing kena infeksi Toxoplasma gondii (RH).(A) Nuduhake owah-owahan sing signifikan ing siRNA sing ana gandhengane karo kekebalan utawa pangembangan tumor sawise infeksi T. gondii RH.(B) Tingkat ekspresi miR-21 relatif dideteksi dening RT-PCR wektu nyata ing exosomes sing diturunake BV2, exosom sing diobati BV2, lan sel U87.(C) Tingkat ekspresi miR-21 relatif ditemokake ing jaringan otak pasien tumor (N = 3) lan tikus sing kena infeksi Toxoplasma gondii (galur ME49) (N = 3). *P <0,05 dipikolehi kanthi uji t Student. *P <0,05 dipikolehi kanthi uji t Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 dipikolehi kanthi nggunakake uji t Student. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 dipikolehi nggunakake uji t Student.
Eksosom saka sel BV2 sing kena infeksi RH nyebabake tuwuhing glioma ing vivo lan in vitro (Gambar 2, 3).Kanggo ndeteksi mRNA sing relevan, kita mriksa tingkat mRNA saka gen target antitumor, kothak forkhead O1 (FoxO1), PTEN, lan pati sel sing diprogram 4 (PDCD4) ing sel U87 sing kena infeksi exosom sing asale saka BV2 utawa RH BV2.Analisis bioinformatika nuduhake manawa sawetara gen sing ana gandhengane karo tumor, kalebu gen FoxO1, PTEN, lan PDCD4, duwe situs pengikat miR-2121,22.Tingkat mRNA saka gen target antitumor dikurangi ing eksosom sing diturunake BV2 sing kena infeksi RH dibandhingake karo eksosom sing diturunake BV2 (Gambar 5A).FoxO1 nuduhake tingkat protein sing suda ing eksosom sing diturunake BV2 sing kena infeksi RH dibandhingake karo eksosom sing diturunake BV2 (Gambar 5B).Adhedhasar asil kasebut, kita bisa ngonfirmasi manawa exosom sing asale saka BV2 sing kena infeksi RH nyuda regulasi gen anti-onkogenik, njaga perane ing pertumbuhan tumor.
Toxoplasma RH-infected BV2-derived exosomes induce suppression of antitumor genes in U87 glioma cells by Toxoplasma RH-infected BV2-derived exosomes.(A) PCR nyata-wektu ekspresi FoxO1, PTEN lan PDCD4 ing eksosom sing asale saka BV2 sing kena infeksi RH T. gondii dibandhingake karo eksosom PBS.mRNA β-aktin digunakake minangka kontrol.(B) Ekspresi FoxO1 ditemtokake dening Western blotting lan data densitometri dievaluasi kanthi statistik nggunakake program ImageJ. *P <0,05 dipikolehi kanthi uji t Student. *P <0,05 dipikolehi kanthi uji t Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 dipikolehi kanthi nggunakake uji t Student. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 dipikolehi nggunakake uji t Student.
Kanggo mangerteni efek miP-21 ing eksosom ing regulasi gen sing gegandhengan karo tumor, sel U87 ditransfeksi karo inhibitor miP-21 nggunakake Lipofectamine 2000 lan sel kasebut dipanen 24 jam sawise transfeksi.Tingkat ekspresi FoxO1 lan p27 ing sel sing ditransfeksi karo inhibitor miR-21 dibandhingake karo sel sing diobati karo exosomes asale BV2 nggunakake qRT-PCR (Gambar 6A, B).Transfeksi saka inhibitor miR-21 menyang sel U87 sacara signifikan nyuda ekspresi FoxO1 lan p27 (Gambar 6).
RH-infèksi exosomal BV2-turunan miP-21 ngrubah ekspresi FoxO1 / p27 ing sel glioma U87.Sel U87 ditransfeksi nganggo inhibitor miP-21 nggunakake Lipofectamine 2000 lan sel dipanen 24 jam sawise transfeksi.Tingkat ekspresi FoxO1 lan p27 ing sel sing ditransfeksi karo inhibitor miR-21 dibandhingake karo tingkat ing sel sing diobati karo exosomes asale BV2 nggunakake qRT-PCR (A, B).
Kanggo uwal saka respon imun host, parasit Toxoplasma malih dadi kista jaringan.Padha parasitize macem-macem jaringan, kalebu otak, jantung, lan otot balung, saindhenging umur inang lan modulate respon imun host.Kajaba iku, bisa ngatur siklus sel lan apoptosis sel inang, ningkatake proliferasi14,24.Toxoplasma gondii umume nginfeksi sel dendritik inang, neutrofil, lan garis keturunan monosit/makrofag, kalebu mikroglia otak.Toxoplasma gondii nyebabake diferensiasi makrofag saka fenotipe M2, nyebabake penyembuhan luka sawise infeksi patogen, lan uga ana hubungane karo hipervaskularisasi lan fibrosis granulomatous.Patogenesis prilaku infèksi Toxoplasma iki bisa uga ana hubungane karo tandha-tandha sing ana gandhengane karo perkembangan tumor.Lingkungan musuhan sing diatur dening Toxoplasma bisa uga meh padha karo prakanker sing cocog.Mulane, bisa dianggep yen infèksi Toxoplasma kudu nyumbang kanggo pangembangan tumor otak.Nyatane, tingkat dhuwur saka infèksi Toxoplasma wis kacarita ing serum saka patients karo macem-macem tumor otak.Kajaba iku, Toxoplasma gondii bisa dadi efektor karsinogenik liyane lan tumindak sinergis kanggo mbantu karsinogen infèksius liyane ngembangake tumor otak.Ing babagan iki, perlu dicathet yen virus P. falciparum lan Epstein-Barr sinergis nyumbang kanggo pembentukan limfoma Burkitt.
Peran exosomes minangka regulator ing bidang riset kanker wis diselidiki kanthi ekstensif.Nanging, peran exosom antarane parasit lan host sing kena infeksi tetep kurang dimangerteni.Nganti saiki, macem-macem regulator, kalebu protèin sing disekresi, wis njlèntrèhaké prosès biologi sing parasit protozoa nolak serangan inang lan terus-terusan infeksi.Bubar, ana konsep sing berkembang yen microvesicles sing ana gandhengane karo protozoa lan mikroRNA berinteraksi karo sel inang kanggo nggawe lingkungan sing cocog kanggo kaslametané.Mula, studi luwih lanjut dibutuhake kanggo nemokake hubungan antarane miRNA eksosomal sing diowahi lan proliferasi sel glioma.Perubahan mikroRNA (gen cluster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 lan miR-17-92) ngiket promotor STAT3 ing makrofag manungsa sing kena infeksi toxoplasma, diatur lan ngindhuksi anti -apoptosis kanggo nanggepi infeksi Toxoplasma gondii 29.Infeksi toxoplasma nambah ekspresi miR-17-5p lan miR-106b-5p, sing ana gandhengane karo sawetara penyakit hiperproliferatif 30.Data kasebut nuduhake yen miRNA inang sing diatur dening infeksi Toxoplasma minangka molekul penting kanggo kaslametan parasit lan patogenesis ing prilaku biologi inang.
MiRNA sing diowahi bisa mengaruhi macem-macem jinis prilaku sajrone wiwitan lan kemajuan sel ganas, kalebu glioma: swasembada sinyal wutah, ora sensitif marang sinyal sing nyegah pertumbuhan, evasion apoptosis, potensial replika tanpa wates, angiogenesis, invasi lan metastasis, lan inflamasi.Ing glioma, miRNA sing diowahi wis diidentifikasi ing sawetara studi profil ekspresi.
Ing panliten iki, kita ngonfirmasi tingkat ekspresi miRNA-21 sing dhuwur ing sel inang sing kena infeksi toxoplasma.miR-21 wis diidentifikasi minangka salah siji saka microRNAs sing paling kerep overexpressed ing tumor padhet, kalebu gliomas, 33 lan ekspresi hubungane karo kelas glioma.Bukti sing ngumpulake nuduhake yen miR-21 minangka onkogen novel sing tumindak minangka faktor anti-apoptosis ing pertumbuhan glioma lan diekspresiake banget ing jaringan lan plasma ganas otak manungsa.Apike, inaktivasi miR-21 ing sel lan jaringan glioma nyebabake inhibisi proliferasi sel amarga apoptosis sing gumantung karo caspase.Analisis bioinformatik saka target prediksi miR-21 ngungkapake macem-macem gen suppressor tumor sing ana gandhengane karo jalur apoptosis, kalebu pati sel terprogram 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, lan kotak forkhead O1 (FoxO1), kanthi situs pengikat miR-2121..22.38.
FoxO1, minangka salah sawijining faktor transkripsi (FoxO), melu pangembangan macem-macem jinis kanker manungsa lan bisa ngatur ekspresi gen supresor tumor kayata p21, p27, Bim, lan FasL40.FoxO1 bisa ngiket lan ngaktifake inhibitor siklus sel kayata p27 kanggo nyegah pertumbuhan sel.Kajaba iku, FoxO1 minangka efektor kunci sinyal PI3K / Akt lan ngatur akeh proses biologis kayata kemajuan siklus sel lan diferensiasi sel liwat aktivasi transkripsi p2742.
Kesimpulane, kita percaya yen miR-21 eksosomal sing asale saka mikroglia sing kena infeksi Toxoplasma bisa uga nduweni peran penting minangka regulator pertumbuhan sel glioma (Gambar 7).Nanging, studi luwih lanjut dibutuhake kanggo nemokake hubungan langsung antarane exosomal miR-21, infèksi Toxoplasma sing diowahi, lan pertumbuhan glioma.Asil kasebut dikarepake bisa menehi titik wiwitan kanggo nyinaoni hubungan antarane infeksi Toxoplasma lan kedadeyan glioma.
Diagram skematis mekanisme karsinogenesis glioma (otak) diusulake ing panliten iki.Penulis nggambar ing PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Kabeh protokol eksperimen ing panliten iki, kalebu panggunaan kewan, sesuai karo Pedoman Etika Standar Perawatan Kewan Universitas Nasional Seoul lan Komite Pengguna lan disetujoni dening Dewan Review Institusi Sekolah Kedokteran Universitas Nasional Seoul (nomer IRB SNU- 150715).-2).Kabeh prosedur eksperimen ditindakake miturut rekomendasi ARRIVE.
BV2 mouse microglia lan sel glioma manungsa U87 dibudidaya ing Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) lan Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), masing-masing ngemot 10% serum sapi janin, 4 mM l- glutamin, penisilin 0,2 mM lan streptomisin 0,05 mM.Sel dikultur ing inkubator kanthi CO2 5% ing suhu 37 ° C.Garis sel glioma liyane, U118, digunakake kanggo mbandhingake karo sel U87.
Kanggo ngisolasi eksosom saka galur RH lan ME49 sing kena infeksi T. gondii, T. gondii tachyzoites (galur RH) dipanen saka rongga abdomen tikus BALB / c 6 minggu sing disuntikake 3-4 dina sadurunge.Tachyzoites dikumbah kaping telu nganggo PBS lan diresiki kanthi sentrifugasi ing 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Kanggo entuk tachyzoites saka galur ME49, tikus BALB / c disuntikake intraperitoneally karo 20 kista jaringan lan transformasi tachyzoite ing kista dikumpulake kanthi ngumbah rongga abdomen ing dina 6-8 sawise infeksi (PI).Tikus kena infeksi PBS.ME49 tachyzoites ditanam ing sel sing ditambah karo 100 μg / ml penisilin (Gibco / BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg / ml streptomycin (Gibco / BRL), lan 5% serum sapi janin (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) ing suhu 37 °C lan karbon dioksida 5%.Sawise budidaya ing sel Vero, tachyzoites ME49 dilewati kaping pindho liwat jarum 25 gauge lan banjur liwat saringan 5 μm kanggo mbusak lebu lan sel.Sawise ngumbah, tachyzoites digantung maneh ing PBS44.Kista jaringan saka Toxoplasma gondii galur ME49 dikelola kanthi injeksi kista intraperitoneal sing diisolasi saka otak tikus C57BL / 6 sing kena infeksi (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Otak tikus sing kena infeksi ME49 dipanen sawise 3 wulan PI lan dicincang ing mikroskop kanggo ngisolasi kista.Tikus sing kena infeksi kasebut disimpen ing kahanan bebas patogen khusus (SPF) ing Sekolah Kedokteran Universitas Nasional Seoul.
Total RNA diekstrak saka exosom, sel BV2 lan jaringan sing asale saka BV2 nggunakake Kit Mini miRNeasy (Qiagen, Hilden, Jerman) miturut instruksi pabrikan, kalebu wektu inkubasi kanggo langkah elusi.Konsentrasi RNA ditemtokake ing spektrofotometer NanoDrop 2000.Kualitas microarrays RNA ditaksir nggunakake bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Walanda).
DMEM karo 10% exosome-miskin FBS disiapake dening ultracentrifugation ing 100,000g kanggo 16 jam ing 4 ° C lan disaring liwat 0,22 µm Filter (Nalgene, Rochester, NY, USA).Sel BV2, 5 × 105, dikultur ing DMEM ngemot 10% FBS exosome-depleted lan 1% antibiotik ing 37 ° C lan 5% CO2.Sawise 24 jam inkubasi, tachyzoites saka galur RH utawa ME49 (MOI = 10) ditambahake menyang sel lan parasit non-invading dibusak sajrone jam lan diisi ulang karo DMEM.Eksosom saka sel BV2 diisolasi kanthi sentrifugasi diferensial sing dimodifikasi, cara sing paling akeh digunakake.Resuspend pelet exosome ing 300 µl PBS kanggo analisis RNA utawa protein.Konsentrasi eksosom terisolasi ditemtokake nggunakake kit assay protein BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) lan spektrofotometer NanoDrop 2000.
Precipitates saka sel BV2 utawa exosomes asalé saka BV2 wis lysed ing PRO-PREP ™ solusi ekstraksi protein (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) lan protein dimuat menyang Coomassie sarwa biru diwarnai 10% SDS polyacrylamide gel.Kajaba iku, protein ditransfer menyang membran PVDF sajrone 2 jam.Western blots divalidasi nggunakake antibodi Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) minangka panandha exosomal.IgG (H + L) kambing konjugasi HRP (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) lan penganalisa gambar luminescent LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokyo, Jepang) digunakake minangka antibodi sekunder..Mikroskopi elektron transmisi ditindakake kanggo nyinaoni ukuran lan morfologi eksosom.Eksosom sing diisolasi saka sel BV2 (6.40 µg/µl) disiapake ing bolong sing dilapisi karbon lan diwarnai kanthi negatif karo 2% uranil asetat suwene 1 menit.Sampel sing disiapake diamati ing tegangan akselerasi 80 kV nggunakake JEOL 1200-EX II (Tokyo, Jepang) sing dilengkapi kamera CCD ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Eksosom sing asale saka BV2 diwarnai kanthi nggunakake PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kanggo menit 15 ing suhu kamar.Sel U87, 2 × 105, kanthi eksosom berlabel PKH26 (abang) utawa ora ana eksosom minangka kontrol negatif, diinkubasi ing 37 ° C sajrone 24 jam ing inkubator CO2 5%.Nukleus sel U87 diwarnai karo DAPI (biru), sel U87 dipasang ing 4% paraformaldehyde kanggo 15 menit ing 4 ° C lan banjur dianalisis ing sistem mikroskop confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Jerman).bisa diamati.
cDNA disintesis saka siRNA nggunakake sintesis untaian pertama Mir-X siRNA lan kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Jepang).PCR kuantitatif wektu nyata ditindakake kanthi nggunakake sistem deteksi PCR wektu nyata iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) nggunakake primer lan template sing dicampur karo SYBR Premix.DNA diamplifikasi kanggo 40 siklus denaturasi ing 95 ° C suwene 15 detik lan anil ing 60 ° C suwene 60 detik.Data saka saben reaksi PCR dianalisis nggunakake modul analisis data saka piranti lunak sistem optik iQ™5 (Bio-Rad).Owah-owahan relatif ing ekspresi gen antarane gen target sing dipilih lan β-aktin / siRNA (lan U6) diitung nggunakake metode kurva standar.Urutan primer sing digunakake ditampilake ing Tabel 1.
Sel glioma 3 x 104 U87 ditanem ing piring sumur 96 lan dicampur karo eksosom sing kena infeksi Toxoplasma sing asale saka BV2 (50 μg / mL) utawa eksosom nonpulse sing asale saka BV2 (50 μg / mL) minangka kontrol ing jam 12, 18 lan 36. .Tingkat proliferasi sel ditemtokake nggunakake Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Jepang) (Tokoh Tambahan S1-S3) 46.
Tikus wuda BALB/c wadon umur 5 minggu dituku saka Orient Bio (Seongnam-si, Korea Selatan) lan disimpen ing kandhang steril ing suhu kamar (22±2°C) lan kelembapan (45±15°C).%) ing suhu kamar (22±2°C) lan asor (45±15%).Siklus cahya 12 jam lan siklus peteng 12 jam ditindakake ing SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Tikus kasebut kanthi acak dipérang dadi telung klompok 5 tikus saben lan kabeh kelompok disuntikake subkutan kanthi 400 ml PBS sing ngemot 1 x 107 sel glioma U87 lan faktor pertumbuhan nyuda BD Matrigel ™ (BD Science, Miami, FL, USA).Enem dina sawise injeksi tumor, 200 mg eksosom sing asale saka sel BV2 (kanthi / tanpa infeksi Toxoplasma) disuntikake menyang situs tumor.Rong puluh loro dina sawise infèksi tumor, ukuran tumor tikus ing saben klompok diukur nganggo caliper kaping telu seminggu, lan volume tumor diitung kanthi rumus: 0,5 × (lebar) × 2 × dawa.
Analisis ekspresi MicroRNA nggunakake miRCURYTM LNA miRNA array, 7 generasi wis, mmu lan rno arrays (EXIQON, Vedbaek, Denmark) panutup 1119 clurut uga-dicirikan antarane 3100 manungsa, mouse lan rat miRNA njupuk probe.Sajrone prosedur iki, 250 nganti 1000 ng total RNA dibuwang saka 5′-fosfat kanthi perawatan karo fosfatase alkalin usus pedhet diikuti label karo pewarna fluoresen ijo Hy3.Sampel sing diwenehi label banjur dihibridisasi kanthi ngemot slide microarray nggunakake kit ruang hibridisasi (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) lan kit slide hibridisasi (Agilent Technologies).Hibridisasi ditindakake sajrone 16 jam ing 56 ° C, banjur microarrays dicuci sesuai karo rekomendasi pabrikan.Slide microarray sing wis diproses banjur dipindai nggunakake sistem scanner microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Gambar sing dipindai diimpor nggunakake piranti lunak Ekstraksi Fitur Agilent versi 10.7.3.1 (Agilent Technologies) lan intensitas fluoresensi saben gambar diukur nggunakake file GAL sing cocog karo protokol Exiqon sing diowahi.Data microarray kanggo sinau saiki disimpen ing database GEO ing nomer aksesi GPL32397.
Profil ekspresi miRNA eksosomal diwasa ing mikroglia saka galur RH utawa ME49 sing kena infeksi Toxoplasma dianalisis nggunakake macem-macem alat jaringan.miRNA sing ana gandhengane karo perkembangan tumor diidentifikasi nggunakake miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) lan disaring kanthi intensitas sinyal normal (log2) luwih saka 8.0.Antarane miRNA, miRNA sing diekspresi kanthi beda ditemokake luwih saka 1,5 kali diowahi kanthi analisis saringan miRNA sing diowahi dening galur RH utawa ME49 sing kena infeksi T. gondii.
Sel dibiji ing piring enem sumur (3 x 105 sel / sumur) ing opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) nggunakake Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Sel sing ditransfeksi dibudidayakan suwene 6 jam banjur diowahi dadi medium komplit seger.Sel dipanen 24 jam sawise transfeksi.
Analisis statistik utamane ditindakake nggunakake Student's t-test kanthi piranti lunak Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Kanggo analisis kewan eksperimen, ANOVA rong arah ditindakake nggunakake piranti lunak Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-values ​​<0,05 dianggep signifikan sacara statistik. P-nilai <0.05 dianggep signifikan sacara statistik. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0,05 dianggep signifikan sacara statistik. P < 0.05 被认为具有统计学意义。 P <0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0,05 dianggep signifikan sacara statistik.
Kabeh protokol eksperimen sing digunakake ing panliten iki disetujoni dening Dewan Review Institusi Sekolah Kedokteran Universitas Nasional Seoul (nomer IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Perkiraan insiden lan kematian kanker global ing 2018: sumber lan metode GLOBOCAN.Interpretasi.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Wawasan babagan faktor risiko tumor otak lan intervensi terapeutik. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Wawasan babagan faktor risiko tumor otak lan intervensi terapeutik.Rashid, S., Rehman, K. lan Akash, MS A review faktor risiko kanggo tumor otak lan intervensi terapeutik utama. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Pangerten jero babagan faktor risiko tumor otak lan intervensi terapeutik.Rashid, S., Rehman, K. lan Akash, MS A review faktor risiko kanggo tumor otak lan intervensi terapeutik utama.Ilmu biomedis.Apoteker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteri-virus ing orodigestive manungsa lan kanker saluran genital wanita: Ringkesan bukti epidemiologi lan laboratorium. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteri-virus ing orodigestive manungsa lan kanker saluran genital wanita: Ringkesan bukti epidemiologi lan laboratorium.Kato I., Zhang J. lan Sun J. Interaksi bakteri-virus ing kanker saluran pencernaan manungsa lan saluran genital wanita: ringkesan data epidemiologis lan laboratorium. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteri-virus ing pencernaan rongga lisan manungsa lan saluran reproduksi wanita: ringkesan ilmu penyakit populer lan bukti laboratorium.Kato I., Zhang J. lan Sun J. Interaksi bakteri-virus ing kanker gastrointestinal manungsa lan kanker genital wanita: ringkesan data epidemiologis lan laboratorium.Kanker 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Saka infeksi nganti kanker: Kepiye virus tumor DNA ngowahi karbon tengah sel inang lan metabolisme lipid. Magon, KL & Parish, JL Saka infeksi nganti kanker: Kepiye virus tumor DNA ngowahi karbon tengah sel inang lan metabolisme lipid.Mahon, KL lan Parish, JL Infeksi geni kanggo kanker: carane virus tumor basis DNA ngowahi karbon tengah sel inang lan metabolisme lipid. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Saka infèksi kanggo kanker: carane virus tumor DNA ngowahi karbon tengah sel inang lan metabolisme lipid.Mahon, KL lan Parish, JL Fires infèksi kanggo kanker: carane virus tumor DNA ngowahi karbon tengah lan metabolisme lipid ing sel inang.Biologi mbukak.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Catechol estrogens saka schistosomes lan flukes ati lan kanker sing gegandhengan karo helminth.ngarep.panas ing njero.5, 444 (2014).